过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞侵袭能力变化

刘畅，谢翠松，陶松桔，宋卫红

(郴州市第一人民医院，湖南郴州 423000)

过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞侵袭能力变化

刘畅，谢翠松，陶松桔，宋卫红

(郴州市第一人民医院，湖南郴州 423000)

目的 观察过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞侵袭能力变化情况。方法 分别用pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13表达质粒和pcDNA3.1/NT-GFP空质粒转染TT细胞，构建空载体pCDNA3.1/NT-GFP-TT细胞系(空载体组)和S100A13稳定过表达甲状腺癌TT细胞系(S100A13过表达组)，采用Transwell侵袭实验观察两组细胞的侵袭能力，蛋白印迹法检测两组细胞酸性成纤维细胞生长因子1(FGF-1)、细胞周期蛋白E(Cyclin E)、CD31蛋白表达。结果 S100A13过表达组、空载体组穿出基质膜的细胞数分别为(83.7±5.0)与(40.0±1.7)个，两组比较P<0.01。S100A13过表达组、空载体组细胞FGF-1蛋白相对表达量分别为1.224±0.124、0.837±0.152，Cyclin E蛋白相对表达量分别为1.034±0.131、0.459±0.032，CD31蛋白相对表达量分别为1.147±0.144、0.312±0.071，两组比较，P<0.05或<0.01。结论 过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞侵袭能力增强，这可能与S100A13促进FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白表达有关。

甲状腺癌；S100A13基因；细胞侵袭；酸性成纤维细胞生长因子1；细胞周期蛋白E

S100蛋白家族是一个有21个成员的钙结合蛋白家族，在多种肿瘤中表达异常，并参与肿瘤的发生发展，在体内发挥多种生物学功能。S100A13是S100蛋白家族中的重要成员之一，在肿瘤及炎症等疾病的病理过程中发挥重要作用[1]。酸性成纤维细胞生长因子1(FGF-1)是成纤维细胞生长因子家族的重要成员之一,其能够刺激血管内皮及平滑肌细胞的增殖与迁移，促进胶原的水解与沉积，最终促进肿瘤细胞的转移[2]。细胞周期蛋白E(Cyclin E)是G1期重要的周期蛋白,与细胞周期蛋白质依赖激酶结合促进pRB的磷酸化,参与肿瘤的发生发展。CD31即血小板-内皮细胞黏附分子1，是一种相对分子质量为130 kD的跨膜糖蛋白，广泛分布在血管的各种细胞上,尤其在培养的血管内皮细胞的连接处存在高表达，可作为机体血管生成的标志，可直接反映移植瘤的微血管生成情况。本课题组前期建立了S100A13稳定过表达人甲状腺髓样癌细胞株(TT)，并证实S100A13基因对TT细胞的增殖有促进作用[3]。本研究观察了过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞侵袭能力变化，并探讨其机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 TT细胞购买于中国科学院细胞库，用含10%胎牛血清(FBS)的F12K培养基于培养箱(37 ℃、5% CO2)中静置培养。兔抗人FGF-1单克隆抗体、抗人CD31单克隆抗体和Cyclin E单克隆抗体均购于士德生物工程有限公司。

1.2 细胞转染及分组 分别用pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13表达质粒和pcDNA3.1/NT-GFP空质粒转染TT细胞。转染24 h后采用荧光显微镜观察转染效率，转染效率达30%，并换用含有500 μg/mL G418的完全培养基筛选阳性克隆，连续筛选4周后形成阳性细胞克隆，构建空载体pCDNA3.1/NT-GFP-TT细胞系和S100A13稳定过表达TT细胞系。将空载体pCDNA3.1/NT-GFP-TT细胞系(空载体组)和S100A13稳定过表达TT细胞系(S100A13过表达组)培养于10%FBS+1%双抗+RPMI1640完全培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。0.25%胰酶消化，2～3 d传代1次。

1.3 细胞侵袭能力观察 采用Transwell侵袭实验。将预冷的无血清RPMI1640培养液按1∶6稀释基质胶，于每个直径8 μm的Transwell小室中铺加50 μL基质胶稀释液，再放置于37 ℃培养箱中过夜成膜。次日将已成膜的小室取出，于小室上腔中加入无血清RPMI1640培养液100 μL，放置20 min，使基质胶水化。分别取上述两组细胞(100 μL)接种在小室的上腔，于下腔中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液。将小室板置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养30～36 h后取出，用棉签轻轻擦弃小室上层细胞，再用PBS液洗涤3遍。将小室置于4%多聚甲醛液中固定10 min，倒置晾干，0.1%结晶祡溶液染色20 min，PBS液清洗，倒置晾干，中性树胶封片。将小室放置在光学显微镜下观察并拍照，于高倍视镜下随机选取4个视野对细胞进行计数，再取平均值，实验重复3次。

1.4 细胞FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白检测 采用蛋白印迹法。提取上述两组细胞的总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离、转膜、含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，FGF-1抗体、CD31抗体和Cyclin E抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。去除一抗，TBST洗膜3次，二抗(1∶1 000)、37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白荧光检测试剂盒(Hyclone．Pierce)显示结果于X线片。扫描蛋白条带灰度值，进行定量，以β-actin为对照。以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为FGF-1、CD31蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞侵袭能力比较 S100A13过表达组、空载体组穿膜侵袭细胞数分别为(83.7±5.0)、(40.0±1.7)个，两组比较，P<0.01。

2.2 两组细胞FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白相对表达量比较 S100A13过表达组、空载体组细胞FGF-1蛋白相对表达量分别为1.224±0.124、0.837±0.152，Cyclin E蛋白相对表达量分别为1.034±0.131、0.459±0.032，CD31蛋白相对表达量分别为1.147±0.144、0.312±0.071，两组比较，P<0.05或<0.01。

3 讨论

S100A13在心肌、骨骼肌、脑组织、胰腺、肾脏、子宫、小肠、甲状腺等器官和组织中均有表达，特别在甲状腺滤泡细胞中高表达。研究[4]发现，S100A13在乳头状甲状腺癌中的表达明显高于癌旁正常组织。在黑色素瘤细胞中，S100A13通过调控细胞因子和NF-κB信号通路参与细胞周期进展和分化[5]，且S100A13的表达状态亦与黑色素瘤患者的复发风险相关[6]。此外，S100A13高表达肺癌细胞侵袭性增强[7]。在转移性癌症患者血清中亦发现S100A13水平升高[8]。上述结果均表明，S100A13增高可能是肿瘤转移的一个重要预报器。侵袭为肿瘤细胞转移的第一步，为了探讨体外S100A13基因过表达在甲状腺癌中的侵袭作用，我们建立了稳定高表达S100A13基因的TT细胞系，研究S100A13基因过表达在体外对TT细胞侵袭能力的影响。本研究结果发现，S100A13稳定过表达甲状腺癌TT细胞较空载体pCDNA3.1/NT-GFP-TT细胞穿过基质膜的细胞数明显增多，表明S100A13过表达能增强甲状腺癌TT细胞的侵袭能力。

FGF-1是一种广谱有丝分裂原与促血管生成因子，其通过激活纤维母细胞生长因子受体发挥生物学效应[9,10]。FGF-1不仅在正常发育与创伤愈合中扮演着重要角色，也在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，表现出癌基因样作用[11]。据文献报道，FGF-1在食管腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达[12～14]，其与血管生成和肿瘤发生等过程密切相关，并在其中起重要作用[15]。FGF-1可促进血管内皮增生，促进血管生成。研究[16]发现，甲状腺癌中S100A13蛋白表达明显高于甲状腺腺瘤和正常组织，其阳性表达与淋巴结转移相关，与FGF-1表达具有很好的一致性。本研究表明，与空载体组相比，S100A13过表达组FGF-1蛋白高表达。据此我们推测，S100A13基因过表达能显著促进TT细胞侵袭可能与FGF-1有关。Cyclin E基因在宫颈鳞癌、卵巢癌、消化道肿瘤、子宫内膜癌中的表达增加[4,6,7]。其高表达可缩短G1期进程，使细胞提前进入S期，从而干扰DNA和中心体复制及分裂，导致细胞转化和肿瘤生成。研究证实，S100A13过表达组中Cyclin E蛋白高表达，S100A13增强甲状腺癌TT细胞的侵袭能力可能与Cyclin E蛋白高表达促进肿瘤细胞增殖有关。CD31为机体血管生成的标志，可直接反映移植瘤的微血管生成情况[14～18]，肿瘤诱导所产生的肿瘤血管网直接影响肿瘤细胞淋巴结转移。研究中我们发现，S100A13过表达组CD31蛋白的表达明显高于空载体组。因此，S100A13增强甲状腺癌TT细胞的侵袭能力可能与CD31高表达促进肿瘤血管生成有关。

综上可见，过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞侵袭能力增强，这可能与S100A13促进FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白表达有关。

[1] Prudovsky I, Mandinova A, Soldi R, et al. The non-classical export routes: FGF-1 and IL-1 alpha point the way [J]. J Cell Sci, 2003,116(24):4871-4881.

[2] Billottet C, Janji B, Thiery JP, et al. Rapid tumor development and potent vascularization are independent events in carcinoma producing FGF-1 or FGF-2[J]. Oncogene, 2002,21(53):8128-8139.

[3] 曹仁贤,田利娜,文芳,等.过表达S100A13基因对甲状腺癌TT细胞生长特性的影响[J].癌症,2008,27(8):822-824.

[4] Martinez-Aguilar J, Clifton-Bligh R, Molloy MP. A multiplexed, targeted mass spectrometry assay of the S100 protein family uncovers the isoform-specific expression in thyroid tumours[J]. BMC Cancer， 2015,15:199.

[5] Massi D, Landriscina M, Piscazzi A, et al. S100A13 is a new angiogenic marker in human melanoma[J]. Mod Pathol, 2010,23(6):804-813.

[6] Azimi A, Pernemalm M, Frostvik Stolt M, et al. Proteomics analysis of melanoma metastases: association between S100A13 expression and chemotherapy resistance[J]. Br J Cancer, 2014,110(10):2489-2495.

[7] Pierce A, Barron N, Linehan R, et al. Identification of a novel, functional role for S100A13 in invasive lung cancer cell lines[J]. Eur J Cancer, 2008,44(1):151-159.

[8] Smirnov DA, Zweitzig DR, Foulk BW, et al. Global gene expression profiling of circulating tumor cells[J]. Cancer Res, 2005,65(12):4993-4997.

[9] Grose R, Dickson C. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005,16(2):179-186.

[10] Presta M, Dell′Era P, Mitola S, et al. Fibroblast growth factor/fibroblast growth factors receptor system in angiogenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16(2):159-178.

[11] Prudovsky I, Mandinova A, Soldi R, et al. The non-classical export routes: FGF1 and IL-1alpha point the way[J]. J Cell Sci, 2003,116(Pt 24):4871-4881.

[12] Soslow RA, Nabeya Y, Ying L, et al. Acidic fibroblast growth factor is progressively increased in the development of oesophageal glandular dysplasia and adenocarcinoma[J]. Histopathology, 1999,35(1):31-37.

[13] Grose R, Dickson C. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005,16(2):179-186.

[14] 田利娜,曹仁贤,刘星,等.shRNA干扰S100A13基因对人甲状腺癌细胞释放成纤维细胞生长因子1的影响[J].中华内分泌代谢杂志,2010,26(10):847-849.

[15] 赵仲生,茹国庆,马杰.细胞周期素E和P53蛋白在胃癌组织中表达及预后意义[J].中国癌症杂志,2003,13(3):211-214.

[16] 刘畅,曹仁贤,钟警,等.甲状腺癌组织中S100A13、FGF-1表达及意义[J].实用癌症杂志,2009,24(1):19-20.

[17] 傅玉峰,丁炯.VEGF表达与胃癌生物学特性的实验研究[J].南京医科大学学报(自然科学版),2006,29(9):749-752.

[18] Shirakawa K, Kobayashi H, Sobajima J, et al. Inflammatory breast cancer: vasculogenic mimicry and it s hemodynamics of an inflammatory breast cancer xenograft model[J]. Breast Cancer Res, 2003,5(3):136-139.

湖南省医药卫生科研计划课题项目(B2014-176)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.012

R736.1

A

1002-266X(2017)02-0040-03