miR-214在舌鳞癌组织中的表达及其对癌细胞顺铂敏感性的影响

唐海波，胡小华，刘敏

(1西南医科大学附属口腔医院，四川泸州646000；2四川护理职业学院附属医院；3遵义医学院附属口腔医院)

miR-214在舌鳞癌组织中的表达及其对癌细胞顺铂敏感性的影响

唐海波1,2，胡小华3，刘敏1

(1西南医科大学附属口腔医院，四川泸州646000；2四川护理职业学院附属医院；3遵义医学院附属口腔医院)

目的 观察miR-214在舌鳞癌组织中的表达情况及其对舌鳞癌细胞系顺铂敏感性的影响，并探讨其可能机制。方法 采用实时荧光定量PCR检测50例份舌鳞癌组织、20例份癌旁组织、10例份正常舌黏膜组织及顺铂耐药舌鳞癌细胞系TCA8113/DDP、亲本舌鳞癌细胞系TCA8113中的miR-214。将miR-214模拟物及其阴性对照转染TCA8113，将miR-214阻遏物及其阴性对照转染TCA8113/DDP，采用实时荧光定量PCR检测细胞中的miR-214，CCK-8实验检测顺铂对细胞的半数抑制浓度(IC50)，Western blot检测细胞中的β-catenin、MDR1蛋白。结果 舌鳞癌组织中miR-214的相对表达量高于癌旁组织、正常舌黏膜组织(P均<0.01)。TCA8113/DDP中miR-214相对表达量高于TCA8113细胞(P<0.01)。转染miR-214模拟物TCA8113细胞中的miR-214、β-catenin蛋白、MDR1蛋白表达水平及顺铂对其的IC50均高于阴性对照细胞(P均<0.05)。转染miR-214阻遏物TCA8113/DDP细胞中的miR-214、β-catenin蛋白、MDR1蛋白表达水平及顺铂对其的IC50均低于阴性对照细胞(P均<0.05)。结论 miR-214在舌鳞癌组织中高表达，下调(上调)miR-214的表达能够提高(降低)人舌鳞癌细胞对顺铂药物的敏感性，其机制可能与对Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。

舌肿瘤；舌鳞癌；微小RNA-214；肿瘤耐药性；Wnt/β-catenin信号通路；β-catenin蛋白；多药耐药1蛋白

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，舌癌是最常见的口腔癌，且以鳞癌为主。目前以手术切除结合放化疗的综合治疗是舌癌的主要治疗方式，手术前或手术后辅以铂类为基础的联合化疗是目前舌癌化疗的首选一线方案，在舌癌的治疗中起着重要的作用。但是由于舌癌耐药性的产生，舌癌综合治疗效果受限[1]。顺铂是舌癌患者常用的化疗药物，目前越来越多舌癌患者对顺铂产生耐药，因此研究其耐药的相关因素及机制，寻找能够有效逆转耐药的治疗靶点是提高临床舌癌综合治疗效果的关键。miR-214是体内重要的miRNA之一，在多种恶性肿瘤中高表达，通过PTEN/AKT、Wnt/β-catenin和酪氨酸激酶信号通路等多种信号通路参与恶性肿瘤的发生发展及侵袭转移[2～4]。多药抗性基因MDR1编码的P-糖蛋白属于ATP 结合盒转运蛋白家族，能够利用ATP水解所释放的能量将部分化疗药物泵出细胞外，从而导致细胞对多种化疗药物产生耐药性。近期研究[5～7]报道miR-214与恶性肿瘤的化疗耐药也密切相关，但目前尚无miR-214与舌癌顺铂耐药的相关性研究报道。本研究观察了miR-214在舌鳞癌组织中的表达情况及其对舌鳞癌细胞系顺铂敏感性的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集 2012年1月～2015年1月在西南医科大学附属口腔医院及遵义医学院附属口腔医院接受手术治疗的50例份舌鳞癌组织及20例份癌旁组织，并收集同期10例份因舌外伤或舌部良性病变行门诊手术切除的周围正常舌黏膜组织。将所有收集的组织在离体20 min内置于液氮速冻，-80 ℃保存备用。所有舌癌患者术前均未接受放化疗或生物免疫治疗。标本的病理诊断由两位病理科高年资医生盲法阅片明确。50例舌癌患者中男28例、女22例，年龄28～70岁、平均51.7岁；组织学分类：高分化20例，中低分化30例；国际抗癌联盟(UICC)TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期26例。有淋巴结转移23例，无淋巴结转移27例。

1.2 细胞及试剂人舌鳞癌细胞系 TCA8113购自中国科学院典型培养物保藏细胞库，人舌鳞癌顺铂耐药细胞系TCA8113/DDP由北京同仁医院实验室惠赠。miR-214模拟物及其阴性对照、miR-214阻遏物及其阴性对照均购自广州锐博生物科技公司；RNA提取试剂TRIzol及Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自北京Promega公司；miR-214引物及内参U6引物由上海生工公司设计合成；活细胞计数(CCK-8)检测试剂盒购自上海东仁化学科技公司；β-catenin、MDR1和GAPDH抗体以及HRP标记羊抗鼠IgG均购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养及转染 TCA8113和TCA8113/DDP均培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规传代。取对数生长期细胞消化后，接种于6孔板，以脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂，严格按说明书操作将miR-214模拟物及其阴性对照转染TCA8113，将miR-214阻遏物及其阴性对照转染TCA8113/DDP。

1.4 组织和细胞中miR-214检测 采用实时荧光定量PCR法。使用TRIzol试剂从组织和细胞中提取总RNA，取300 μg RNA,分次逆转录合成cDNA第一链，由PCR引物及第一链为模板进行PCR，反应条件为95 ℃ 1 min变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，共40个循环。以U6作为内参基因。实验重复3次，采用2-ΔΔCt法计算组织和细胞中miR-214的相对表达量。

1.5 顺铂对细胞半数抑制浓度(IC50)检测 采用CCK-8法。取转染后细胞消化后，接种于96孔板常规培养过夜，随后取顺铂溶液进行等比稀释，使得终浓度分别为1.25、2.5、5、10、20 μg/mL后加入细胞中继续培养。以加细胞和培养基而不加顺铂者作为空白对照。继续培养48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养箱孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率，抑制率(%)=(1-A实验组/A空白对照)×100%。根据细胞生长抑制率计算顺铂对细胞的IC50，每组细胞设6个复孔，实验重复3次。

1.6 细胞中β-catenin、MDR1检测 采用Western blot法。收集转染后细胞，加入蛋白裂解液后静置冰上30 min，充分匀浆裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白样品浓度。每个标本取90 μg蛋白上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入适当浓度一抗，4 ℃过夜，次日洗膜后，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜后将膜置于ECL中，于凝胶成像系统中曝光并采集图像，结果以其与管家基因GAPDH含量的比值表示，实验重复3次。

2 结果

2.1 舌鳞癌组织、癌旁组织、正常舌黏膜组织中miR-214表达比较 舌鳞癌组织、癌旁组织、正常舌黏膜组织中miR-214的相对表达量分别为5.67±0.66、0.98±0.13、1.03±0.11，舌鳞癌组织中miR-214的相对表达量高于癌旁组织、正常舌黏膜组织﹙P均<0.01﹚，癌旁组织与正常舌黏膜组织中miR-214的相对表达量比较差异无统计学意义。

2.2 TCA8113/DDP、TCA8113细胞中miR-214表达比较 TCA8113/DDP、TCA8113细胞中miR-214相对表达量分别为8.11±1.51、1.07±0.09，TCA8113/DDP中miR-214相对表达量高于TCA8113细胞(P<0.01﹚。

2.3 顺铂对转染miR-214模拟物及其阴性对照TCA8113细胞的IC50比较 转染miR-214模拟物及其阴性对照TCA8113细胞中miR-214的相对表达量分别为5.11±0.24、1.01±0.04，两者比较P<0.01。顺铂对转染miR-214模拟物及其阴性对照TCA8113细胞的IC50值分别为(7.89±0.10)、(2.54±0.04)μg/mL，两者比较P<0.05。

2.4 顺铂对转染miR-214阻遏物及其阴性对照TCA8113/DDP细胞IC50比较 转染miR-214阻遏物及其阴性对照TCA8113/DDP细胞中miR-214的相对表达量分别为0.34±0.03、1.06±0.06，两者比较P<0.01。顺铂对转染miR-214阻遏物及其阴性对照TCA8113/DDP细胞的IC50值分别为(3.10±0.06)、(8.69±0.11)μg/mL，两者比较P<0.05。

2.5 TCA8113/DDP、TCA8113细胞中β-catenin和MDR1蛋白表达比较 转染miR-214模拟物及其阴性对照TCA8113细胞中β-catenin蛋白的相对表达量分别为1.13±0.10、0.28±0.09，MDR1蛋白的相对表达量分别为1.28±0.14、0.11±0.06，两者比较P均<0.01。转染miR-214阻遏物及其阴性对照TCA8113/DDP细胞中β-catenin蛋白的相对表达量分别为0.24±0.11、0.72±0.13，MDR1蛋白的相对表达量分别为0.13±0.08、0.87±0.10，两者比较P均<0.01。

3 讨论

舌癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，尽管目前采用扩大根治手术结合放化疗治疗，但总体治疗效果仍然欠佳。铂类药物是目前治疗舌鳞癌的一线化疗药物之一，但遗憾的是，许多患者对铂类药物耐药，肿瘤细胞产生化疗耐药性常导致治疗失败，因此研究其耐药的相关因素及机制，寻找能够有效逆转耐药的治疗靶点意义重大。

miRNA是人体内一类非编码双链RNA，通过与靶基因mRNA的3′UTR互补结合，在转录后水平调控靶基因的表达，已被证实miRNA在肿瘤的发生发展过程中扮演着促癌基因或者抑癌基因的角色，并且近年来越来越多研究[8]表明miRNA的异常表达与肿瘤细胞的化疗药物耐药有关。

miR-214是miRNA家族重要成员之一，在细胞发育、细胞衰老及血管形成等生理过程中发挥着重要的作用[9,10]。近年来研究发现，miR-214在多种恶性肿瘤中表达异常，与肿瘤发生发展关系密切。miR-214在鼻咽癌[2]、恶性黑色素瘤[11]及胰腺癌[4]等肿瘤中表达明显增高，起着类似癌基因的作用，而在乳腺癌[12]、胃癌[13]等肿瘤中表达明显降低，起着类似抑癌基因的作用。本研究中发现，miR-214在舌鳞癌组织中高表达，结果与Scapoli等[14]的研究结果一致。近期研究[15～17]报道，miR-214与恶性肿瘤的顺铂耐药有关。本研究发现miR-214在顺铂耐药舌鳞癌细胞系TCA8113/DDP中表达明显高于亲本舌鳞癌细胞系TCA8113，推测miR-214可能参与舌鳞癌细胞对顺铂耐药。进一步通过细胞转染技术上调TCA8113细胞系中miR-214的表达发现，顺铂对细胞IC50明显增高，说明上调TCA8113细胞系中miR-214的表达能够降低细胞对顺铂的敏感性。同时，下调TCA8113/DDP细胞系中miR-214的表达发现顺铂对细胞IC50明显降低，说明下调TCA8113/DDP细胞系中miR-214的表达能够增加细胞对顺铂的敏感性。

β-catenin是经典Wnt通路的关键基因，Wnt/β-catenin通路主要通过激活β-catenin在核内的功能来调节靶基因。细胞内β-catenin的积聚是Wnt信号通路异常激活的特征，可以激活许多下游靶基因[18]。Wnt/β-catenin通路与顺铂耐药的关系已得到大量研究证实，Wnt/β-catenin通路中与耐药有关的下游靶基因包括MDR1、MRP1、MRP2、ITF-2、MMP-7、COX-2、c-myc、cyclinD1、bcl-2等[19～22]。已有研究[23,24]表明，miR-214在恶性肿瘤中对细胞生物学行为的调控与Wnt/β-catenin通路有关。miR-214在舌癌中顺铂耐药是否与Wnt/β-catenin通路有关尚不明确。本研究发现上调TCA8113细胞系中miR-214的表达，细胞中β-catenin和MDR1的表达也明显升高，下调TCA8113/DDP细胞系中miR-214的表达，细胞中β-catenin和MDR1的表达也明显降低，说明miR-214对舌鳞癌细胞顺铂敏感性的影响机制与对Wnt/β-catenin信号通路的调控有关，但miR-214调控Wnt/β-catenin信号通路的具体机制尚需在后续的实验中进一步研究。

综上所述，miR-214在舌鳞癌组织中高表达，下调(上调)miR-214的表达能够提高(降低)人舌鳞癌细胞对顺铂药物的敏感性，其机制可能与对Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。

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Expression of miR-214 in tongue squamous-cell carcinoma and itseffects on cisplatin resistance

TANGHaibo1,HUXiaohua,LIUMin

(1TheAffiliatedOralHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To explore the expression of miR-214 in tongue squamous-cell carcinoma (TSCC) and its effects on cisplatin resistance in tongue squamous-cell carcinoma cells, and to explore the underlying mechanism.Methods The expression level of miR-214 was detected by real-time PCR in 50 samples of TSCC tissues, 20 samples of para-carcinoma tissues,10 samples of normal tongue mucosa tissues, TCA8113/DDP cells and TCA8113 cells. The TCA8113 cells were transfected with miR-214 mimics (miR-214 mimics group) or mimics-NC (mimics-NC group), and the TCA8113/DDP were transfected with miR-214 inhibitor (miR-214 inhibitor group) or inhibitor-NC (inhibitor-NC group). The expression level of miR-214 was detected by real-time PCR, the half maximal inhibitory concentration (IC50) value of DDP by CCK8 and the expression level of β-catenin and multidrug resistance (MDR) 1 protein by Western blotting.Results The expression of miR-214 in the TSCC tissues was significantly higher than that in para-carcinoma tissues and normal tongue mucosa tissues (allP<0.05). The expression level of miR-214 in the TCA8113/DDP cells was significantly higher than that in TCA8113 cells (P<0.05). After TCA8113 cells were transfected with miR-214 mimics, the IC50value and expression levels of miR-214, β-catenin and MDR1 in the miR-214 mimics group were significantly higher than those in the mimics-NC group (allP<0.05). After TCA8113/DDP cells were transfected with miR-214 inhibitor, the IC50value and expression levels of miR-214, β-catenin and MDR1 in the miR-214 inhibitor group were significantly lower than those in the inhibitor-NC group (allP<0.05).Conclusion The expression of miR-214 is highly expressed in the tongue squamous-cell carcinoma, the down-regulation(up-regulation) of miR-214 can effectively increase (decrease) the sensitivity of tongue squamous-cell carcinoma cells to cisplatin, and this effect of miR-214 may be partly due to its regulation of Wnt/β-catenin signal pathway.

tongue neoplasms; tongue squamous-cell carcinoma; mocro RNA-214; drug resistance of tumor; Wnt/β-catenin signal pathway; β-catenin protein; multidrug resistance 1 protein

四川省科技厅-泸州市科技局-泸州医学院联合项目(LY-51)；贵州省科教青年英才培养工程[黔省专合字(2012)192号]。

唐海波(1983-)，男，硕士研究生，主治医师，主要研究方向为口腔颌面部肿瘤治疗。E-mail： tanghaibokqk@yeah.net

刘敏(1965-)，女，硕士研究生导师，教授，主任医师，主要研究方向为口腔种植。E-mail: dr_liumin@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.003

R739.86

A

1002-266X(2017)02-0010-04

2016-09-20)