转Cry5 Aa基因棉花品系的遗传稳定性研究

王峰　周仲华

摘要：为检测转Cry5Aa基因棉花品系的遗传稳定性，为品种安全性评价提供依据，本研究结合大田性状比较、卡那霉素检测和PCR分子检测，研究转Cry5Aa基因棉花品系杂交后代遗传特性和群体遗传特性的稳定性，结果表明：F1代均为抗性个体，F2代正反交组合抗性分离比例均接近3：1，表明外源基因为显性并稳定插入到基因组中，说明JX0010品系抗虫性状纯合度高，性状一致性好。

关键词：转基因；Cry5Aa；棉花；遗传稳定性

中图分类号：S562.035 文献标识码：A 文章编号：2095—3143（2016）06—0003—04

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2016.06.001

0引言

从20世纪80年代初开始，育种学家应用分子生物学手段，将外源抗虫基因转入农作物体内以期获得转基因抗虫品种。1987年Agracetus公司第一次以柯字312为受体培育成功遗传工程棉，中国农业科学院生物技术研究所郭三堆等，1992年通过人工合成（Bt）GFM-CryIA杀虫基因和能在棉花体内高效表达的调控元件序列，培育成功拥有自有知识产权的转基因抗虫棉品种并在全国大力推广，目前我国转基因抗虫棉占棉花种植面积的一半以上。但是，含Cryl4单价抗虫基因的棉花品种在我国棉花生产中已推广应用10多年，棉铃虫对Bt基因耐受性逐年增加，抗性风险已越来越大。Cry5Aa基因是兼抗鳞翅目害虫及线虫的抗虫基因，本课题组2001年将Cry5Aa基因采用花粉管通道法导人“湘棉12号”，2002年夏获得转基因抗虫棉株系，2003年育成转基因抗虫棉品系（代号为JX0010）。作为一个新的转基因抗虫棉品系，其遗传稳定性对于该品系的应用具有重要的意义，因此，作者结合大田性状比较、卡那霉素检测和PCR分子检测，研究其杂交后代遗传特性和群体遗传特性的稳定性，为该品系的应用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

棉花遗传标准系TM-1、中棉所12号均由中国农业科学院棉花研究所棉花种质资源室提供，湘棉10号、转Cry5Aa棉花品系JX0010均由湖南农业大学棉花研究所提供。

1.2试验时间及地点

2007年和2008年分别在湖南省南县民山头大木桥二组、华容县菜市镇桥头村五组、常德市鼎城区牛鼻滩乡三星村、大通湖区河坝镇庆成村、澧县张公庙五组和湖南农业大学棉花研究所校内科研基地共6个地点进行。

1.3杂交测试

以JX0010、TM-1、湘棉10号和中棉所12号为父母本，配制6个以JX0010正反交杂交组合，组合以A、C、D、E、F、G编号（见表1）。人工去雄杂交，所得种子种植在指定的试验基地，通过自交获得F₂代种子。对F2代进行卡那霉素检测，对卡那霉素检测出的阳性株再进行PCR分子检测，确定Cry5Aa基因的遗传规律和遗传稳定性。

1.4抗虫基因的PCR检测

1.4.1棉花基因组提取及检测 参照Paterson，等和张金发，等的CTAB法从子叶中快速提取棉花基因组DNA，在1%的琼脂糖凝胶上电泳检查提取的基因组DNA，经溴化乙锭（EB）染色后紫外观察照相。1.2.2

Cry5Aa基因的PCR扩增PCR反应总体积为25 uL，其中含有Mg²⁺（25 mM）1.5 uL，dNTPs（10 mM）0.5 uL，上下游引物（10 M）各1 uL，TaqDNA聚合酶（1U/uL）1 uL，10 Reaction buffer 2.5 uL，模板DNA（50ng/uL）1 uL，ddH20 16.5 uL；DNA扩增反应是在ABl2720 PCR仪上进行，反应程序：95T：预变性4 min，94%变性1 min，55℃退火50 s，72%延伸50 s，经30个循环，72%延伸10 min，4℃保存，0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。

2结果分析

2.1杂种F₁代的测试结果

以JX0010为母本的杂种F₁代3个组合，分别编号为A、C、D，称之为正交组合；以JX0010为父本的杂种F₁代3个组合，分别编号为E、F、G，称之为反交组合。各组合在湖南农业大学科研基地种植1500株，成活1300株左右，定苗1200株。8叶期用1200 ug/ml卡那霉素点涂主茎倒数第3叶，点涂后5～7 d调查卡那霉素阳性反应株。结果表明：A、E两个组合阳性株率达100%，是所有组合中最高的；D、G两个组合阳性株率略低，分别为99.2%、99.5%；而C、F两个组合则达99.9%。且大田抗虫性正反交各组合之间无显著差异（P>0.05），表明F₁代均为抗性个体，JX0010品系抗虫性状纯合度高，抗虫性状一致性好。

2.2 F₂代的抗性遗传分析

杂交F1代自交获得的F2代种子，6个组合每个组合种植480m²，1500株左右，棉株8叶期用卡那霉素（1200 ug/ml）点涂主茎倒数第3叶，5 d后调查阳性株率。随后对阳性反应株采用Cry5Aa特异引物进行PCR检测，去除假阳性株。通过卡平方检验分析遗传率和遗传稳定性。

分析结果表明：不同亲本正反交组合问存在差异，但均未达到显著水平，其抗虫性基本符合显性单基因3（抗蟲）：1（非抗虫）的遗传规律，且组合间稳定性较好，以JX0010为母本的正交组合经过PCR检测的阳性株数（检测结果见图1）与阴性株数之比为3.13：1，而以JX0010为父本的反交组合其比值为2.97：1，两者间无显著差异（表2）。表明转Cry5Aa基因棉花品系JX0010抗虫性的遗传稳定性好。

2.3 F₁回交一代的抗性分析

A、C、D、E、F、G杂交组合F₁与各自的非抗虫亲本回交，共获得6个回交一代，种植后于棉株8叶期左右用卡那霉素点涂主茎倒数第3叶，卡那霉素点涂浓度为1200 ug/ml，5 d后调查点涂叶片有无黄颜色斑点，凡无黄色斑点的植株，记为卡那霉素阳性反应植株，以卡那霉素阳性株除以点涂总株数计算出阳性株率（结果列于表3）。表明该基因符合单基因显性遗传规律（1：1）。

3结论与讨论

本研究结合大田性状比较、卡那霉素检测和PCR分子检测，研究了转Cry5Aa基因品系杂交后代遗传特性的分离规律和群体的遗传稳定性，结果表明F₁代均为抗性个体，F₂代正反交组合抗性分离比例（抗虫：非抗）均接近3：1，表明外源基因为显性并稳定插入到基因组中，JX0010品系抗虫性状纯合度高，性状一致性好。

对于转基因作物来说，外源基因能否在后代中稳定地遗传和表达是基因工程技术实用化研究中的关键问题。在理论上，外源基因一旦整合进入受体的核基因，插入的外源基因能在减数分裂中留存下来，就能够稳定地通过有性繁殖传递给后代，并保持减数分裂的稳定性。但是，在实际操作中，常遇到多拷贝与重复转基因序列造成的基因沉默，使外源基因不能在转基因作物中稳定表达，甚至不表达。特别是花粉管通道法由于外源基因插入的随机性而更易于这种现象的发生。本研究通过花粉管通道法获得了一个转基因品系，通过实验证明外源基因为显性并稳定插入到基因组中，为该基因的应用提供了较好的支撑。