骨髓间充质干细胞联合外源性Shh蛋白对骨髓造血干细胞增殖的影响

朱小凤，黄纯兰，李晓明

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

骨髓间充质干细胞联合外源性Shh蛋白对骨髓造血干细胞增殖的影响

朱小凤，黄纯兰，李晓明

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMMSC)联合外源性Shh蛋白干预对骨髓造血干细胞(HSC)增殖的影响。方法分别采用全骨髓培养法、磁珠分选法(MASC)从正常志愿者骨髓中分离BMMSC、HSC，并用流式细胞术进行鉴定。将分选好的HSC随机分为三组，MSC+HSC+Shh组Transwell培养板上室接种用IMDM培养基+500 ng/mL的Shh蛋白重悬的HSC，下室接种BMMSC；BMMSC+HSC组上室接种用IMDM培养基重悬后的HSC，下室接种BMMSC；HSC+Shh组上室接种用IMDM培养基+500 ng/mL的Shh蛋白重悬的HSC，下室加入培养基；对照组上室接种用IMDM培养基重悬的HSC，下室加入培养基。各组均培养72 h，用计数板计数HSC活细胞数。结果培养72 h，HSC+BMMSC+Shh组HSC细胞计数较其他各组高(P均<0.05)，HSC+MSC组、HSC+Shh组较HSC组高(P均<0.05)，HSC+BMMSC组、HSC+Shh组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMMSC与外源性Shh蛋白可协同作用共同促进HSC增殖。

骨髓造血干细胞；骨髓间充质干细胞；Shh蛋白；细胞增殖

骨髓造血干细胞(HSC)是一种多能干细胞，是一群最原始的并具有多向分化潜能的造血细胞，具有高度的自我复制潜能。HSC移植可重建受者造血和免疫功能，是治疗各种良恶性血液病的有效手段。如何简便、快速分离及扩增高纯度的HSC是当前研究的热点。骨髓间充质干细胞(BMMSC)可分泌多种细胞趋化因子、细胞因子及细胞外基质，调节HSC的归巢和增殖，具有支持造血和免疫调节功能。Shh信号通路是在动物胚胎发育过程中起重要作用的信号通路之一[1]。Shh在很多组织中调控细胞增殖和分化[2～4]，外源性的Shh蛋白可以促进造血干细胞的增殖[5]。2014年8月～2015年3月，本研究观察BMMSC联合外源性的Shh蛋白对HSC的调控作用，为HSC的体外扩增提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源 FBS购自Hyclone公司，低糖DMEM购自Invitrogen公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，人抗鼠CD34-ECD、CD105-FITC、重组人干细胞因子(SCF)购自美国Peprotech公司，CD45-PCy7购自美国BD公司。IL-3购自美国Peprotech公司，Shh蛋白购自R&D system公司，Transwell培养板购自Corning公司，流式细胞仪购自Beckman公司，微型磁珠分选仪(mini MACS)购自Miltenyibiotec公司。

1.2 BMMSC分离、培养及鉴定 在无菌条件下抽取正常志愿者(22例，均为本院体检健康者，男15例、女7例，年龄20～45岁)骨髓约6 mL，用全骨髓培养法，加入含10% FBS的低糖DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。培养至第8天，当细胞融合度达70%～80%时，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。传至第3代，将细胞用PBS洗2遍后，用0.25%胰蛋白酶消化第3代细胞，PBS冲洗后，分别用人抗鼠CD34-ECD、CD105-FITC、CD45-PCy7标记。采用流式细胞术进行细胞学鉴定。

1.3 HSC分选及鉴定 无菌条件下抽取志愿者骨髓约12 mL。用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNCs)，采用磁珠分选法，按照mini MACS说明书进行CD34+细胞分选，将分选的细胞用CD34+细胞试剂盒进行表面抗原抗体标记，采用流式细胞术进行细胞学鉴定。

1.4 HSC增殖能力检测 将分选成功的HSC随机分为三组。BMMSC+HSC+Shh组：收集HSC用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL链霉素的IMDM培养基+500 ng/mL的Shh蛋白重悬制成细胞悬液，按照每孔100 μL的细胞悬液接种于Transwell培养板上室内，HSC为1×105/孔；将含BMMSC培养液600 μL接种于Transwell培养板下室，BMMSC为1×106/孔。BMMSC+HSC组：收集HSC用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL链霉素的IMDM培养基重悬制成细胞悬液，按照每孔100 μL的细胞悬液接种于Transwell培养板上室内，HSC为1×105/孔；将含BMMSC培养液600 μL接种于Transwell培养板下室，BMMSC为1×106/孔。HSC+Shh组：将HSC接种于Transwell培养板上室，接种方法同BMMSC+HSC+Shh组，下室加入相应的培养基。对照组：上室仅添加IMDM培养基重悬的HSC，下室加入相应的培养基。培养72 h，将Transwell上室加入IMDM培养基500 μL，用吸管反复轻轻吹打，将细胞移入试管，室温下，离心(1 000 r/min)5 min，弃上清液。加入培养基500 μL重悬细胞，用计数板计数HSC活细胞数。

2 结果

2.1 细胞鉴定结果 CD105+而CD34-、CD45-的细胞即为BMMSC，培养4 d，光镜下可见少数梭形贴壁细胞，呈单个或成簇存在；培养7 d，细胞呈融合状态；细胞比例为52.4%。CD34+细胞即为HSC，镜下可见呈圆形，比例为81.9%。台盼兰拒染试验检测细胞活率均大于95%。

2.2 各组HSC增殖能力比较 共培养72 h，HSC+MSC+Shh组、HSC+MSC组、HSC+Shh组、HSC组HSC细胞计数分别为(25.200±6.138)、(7.825±0.624)、(6.900±2.049)、(1.500±1.291)×105个。HSC细胞计数比较，HSC+MSC+Shh组较其他各组高(P均<0.05)，HSC+MSC组、HSC+Shh组较HSC组高(P均<0.05)，HSC+MSC组、HSC+Shh组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

BMMSC作为骨髓基质细胞的一种，是造血微环境中的重要组成部分。BMMSC不但对造血干细胞的生长起支持作用，而且还分泌多种细胞因子，进而调节造血干细胞的增殖与分化[6～8]。BMMSC可支持HSC的生长[9,10]，促进HSC的快速增殖，维持HSC池的扩增和自我更新，保持HSC的多向分化潜能。BMMSC的这些作用可能与其分泌的细胞因子、表面的黏附分子受体和细胞外基质有关[11]。分泌的黏附分子受体和细胞外基质分子能够为HSC的增殖提供基础。并且BMMSC分泌的细胞因子参与调控HSC增殖、分化、凋亡、生长抑制、趋化和随意运动等。同时BMMSC可以分泌多种促进HSC增殖又抑制其分化的细胞因子。BMMSC能够分泌血管再生各种所需的细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管生成素等。目前认为，VEGF、血管生成素1(Ang-1)及Ang-2在毛细血管形成过程中发挥重要作用[12]。BMMSC促进HSC增殖可能还与其分泌的促血管生长因子相关，促进血管形成，为HSC的生长提供营养物质，更有利于促进其增殖。研究证实，不同的细胞作为滋养层模拟体内造血微环境对促进HSC增殖和修复的重要性[13]。基于BMMSC分泌的细胞因子可以促进HSC的增殖[14]。本研究将HSC与BMMSC加入Transwell培养板中进行共培养，72 h后HSC出现了增殖现象。其原因可能为在共培养过程中，下室的BMMSC分泌的多种细胞因子穿过Transwell培养板的微网进入上室，从而促进HSC增殖。但具体BMMSC分泌的哪些细胞因子促进了HSC增殖，在后期研究中将对其进行检测。本文对研究骨髓造血微环境，特别对BMMSC促进HSC体外扩增的机制有了进一步的阐释，为研究HSC体外长期扩增以及培养提供基础。

Hedgehog基因作为一种分节性极性基因，在哺乳动物中有3个同源基因，包括编码Shh蛋白的SHH基因、编码Ihh蛋白的IHH基因和编码Dhh蛋白的DHH基因[15]。用可溶性的Shh处理过的人HSC在小鼠体内可生产大量的人造血细胞。表明，HSC对Hh信号起了应答反应，并进行了自我更新。在稳态下，激活Hh信号通路可以促进原始血细胞的扩增[16]。研究证明Hh信号可以抑制细胞因子诱导的人HSC增殖，而加入可溶性的Shh蛋白可诱导HSC的增殖和扩展[17]。加入外源性Shh蛋白内可触发成血-血管干细胞的增殖[18]。另有研究发现，在体外加入外源性Shh蛋白可以促进HSC/祖细胞(HSC/HPC)的增殖，其促HSC/HPC增殖的作用是通过BMP-4实现的[19]。本研究亦证实，外源性Shh蛋白可促进HSC增殖。

Shh可以促进BMMSC增殖分化，并可促进HSC的增殖，BMMSC也可以促进HSC增殖,但两者在促进HSC增殖方面是否存在协同作用是本研究的目的。外源性的Shh蛋白可促进HSC增殖，而将外源性的Shh蛋白加入BMMSC与HSC共培养的Transwell中，之前很少有相关研究。本研究将外源性的Shh蛋白与BMMSC联合，模拟造血微环境，观察其对HSC的调控作用。研究证实，Shh联合BMMSC促进了HSC的增殖。说明Shh蛋白与BMMSC之间存在相互协同作用，共同促进HSC的增殖。猜测Shh蛋白在促进HSC增殖的同时，也可能作用于BMMSC，促进其某些促造血成分的分泌，导致相关信号通路分子的表达上调。外源性的Shh蛋白与BMMSC联合共同促进HSC增殖的机制将是继续研究的方向。

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