微环境中不同因素对肺癌干细胞影响的研究进展

唐为安，徐兴祥，杨俊俊

(1中南大学湘雅二医院，长沙 410075；2江苏省苏北人民医院)

·综述·

微环境中不同因素对肺癌干细胞影响的研究进展

唐为安1，徐兴祥2，杨俊俊2

(1中南大学湘雅二医院，长沙 410075；2江苏省苏北人民医院)

肺癌干细胞(LCSC)是一小群具有不断自我更新和分化能力的肿瘤细胞，微环境是指其邻近的细胞及其分泌的细胞因子。微环境和LCSC作用机制十分复杂，二者相互促进又相互拮抗，微环境中炎性因子、低氧、新生血管、细胞外基质等因素能够促进或抑制LCSC的干细胞性。

肺癌；干细胞；微环境；炎性因子；低氧；新生血管；细胞外基质

肺癌干细胞(LCSC)是一小群具有不断自我更新和分化能力的肿瘤细胞，以往研究多集中于LCSC本身，随着研究的深入，发现微环境是维持LCSC状态和功能的重要条件。LCSC微环境是指其邻近的细胞及其分泌的细胞因子。正常干细胞由微环境“干细胞龛”维持干细胞状态，LCSC也需要一个特殊的微环境进行调控。微环境和LCSC作用机制十分复杂，二者相互促进又相互拮抗。许多研究表明，微环境中炎性因子、低氧、新生血管、细胞外基质等因素影响LCSC，它们不仅可以直接促进普通肿瘤细胞向LCSC转变，还能使非肿瘤干细胞向LCSC转变。研究微环境中不同因素影响LCSC的机制，就能在抑制肺癌生长和转移方面提高效率[1]。现就微环境中不同因素对LCSC影响的研究进展进行综述。

1 炎性因子

许多临床实验研究已证实炎症是肿瘤发生的有利条件，而炎症对LCSC的作用机制则是目前肿瘤研究的新领域。在LCSC微环境中存在各种类型的免疫细胞，这些免疫细胞经过LCSC诱导达到微环境后，分泌大量的细胞炎性因子如IL-6、IL-8、TGF-α等，影响LCSC增殖和分化，维持LCSC不断自我更新的能力。

1.1 肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 在肿瘤发展的早期，TAM是最主要的炎症细胞，包括经典活化M1型和替代活化M2型。M1型具有分泌多种炎性因子的功能，M2型功能与M1型相反，具有抗炎的作用。Jinushi等[2]发现，M1型TAM能够释放乳脂肪球表皮生长因子Ⅷ9(MFG-E8)调节LCSC的活性，MFG-E8能通过激活LCSC中STAT-3和Sonic Hedgehog通路提升LCSC的致瘤性和药物抵抗，且MFG-E8在炎性因子IL-6的存在下能够进一步提升LCSC耐药性。M2型TAM在LCSC的形成中具有独特的作用。Huang等[3]发现，M2型TAM可通过黏蛋白1(MUC1)诱导LCSC形成并维持其干细胞性。

1.2 IL-6 IL-6是一种多效性前炎症细胞因子，由多种免疫细胞分泌，并且在多种炎症反应中高表达。IL-6过表达可以诱导肺间充质干细胞转化为LCSC[4]。IL-6对LCSC生长与增殖也起启动作用。Lee等[5]从A549、H157、H1299非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系分离出CD133+和CD133-细胞亚群，分析IL-6对细胞生长转移能力和上皮-间质转化(EMT)的影响，发现敲除IL-6的CD133-细胞并没产生明显改变，但是敲除IL-6的CD133+细胞自我更新能力明显低于对照CD133+细胞，可见IL-6对于CD133+细胞生长具有启动子作用，敲除IL-6导致LCSC细胞生长迟缓。IL-6的表达伴随着一些特殊蛋白的升高，有研究显示在慢性炎症中IL-6的表达伴随着CXCR4的表达上升。CXCR4是一个7次跨膜的G蛋白偶联受体，可通过上调CYP1B1来提升非小细胞肺癌患者的化疗抵抗性。Tu等[6]发现非小细胞肺癌转移的患者中IL-6和CXCR4水平较无转移的患者显著升高。

1.3 活性氧(ROS) 活化的免疫细胞能够不断产生ROS，ROS可直接作用于DNA导致损伤，导致肺部正常干细胞发生基因突变形成LCSC。细胞内的ROS能够激活对氧化还原反应敏感的转录因子，促进肿瘤的形成[7]。目前很多研究发现，ROS促进LCSC侵袭和转移，但持续高强度的ROS有助于杀伤LCSC。ROS诱导的半胱氨酸S-谷胱甘肽化是控制细胞内许多蛋白质翻译后修饰活性的重要产物，ROS可以通过S-谷胱甘肽化调节LCSC的形成。Wang等[8]通过LBL21消耗A549细胞内谷胱甘肽(GSH)，导致线粒体呼吸和跨膜电位降低，线粒体功能障碍和ROS积累，结果A549细胞表现出细胞中侧群细胞比例降低和干细胞标志物Oct-4、SOX-2、CD133表达下降，可见通过高表达ROS能够抑制A549细胞内干细胞的生成。

2 低氧

肿瘤细胞增殖需要消耗大量的氧，低氧环境是肿瘤组织普遍存在的现象。低氧是LCSC微环境的重要特点[9]。在缺氧条件下，肿瘤细胞为了缓解大量增殖的压力，不断改变自身表型并向远处转移，容易导致基因突变和LCSC的形成。

2.1 转录因子Oct-4 LCSC多位于缺氧区域，细胞可能通过去分化来逃避缺氧持续存在时的压力，获得干细胞性。传统研究表明，Oct-4在肺部正常细胞中不表达，说明肺组织发育成熟，但是缺氧促进Oct-4在肿瘤细胞中表达，在缺氧刺激下Oct-4激活并重新编程肺癌细胞，促进肺癌细胞的去分化。缺氧条件下的肺癌细胞中Oct-4高度表达，诱导了细胞不规则分裂和细胞周期停滞。在肺腺癌细胞中过表达Oct-4能够诱导LCSC的形成，可见由缺氧引起的去分化过程很可能是LCSC形成的关键[10]。Oct-4还可以诱导肺癌细胞的EMT，促进肿瘤细胞的转移和干细胞性的形成。Oct-4的阳性表达与E-cad异常表达有关，而E-cad被认为是肿瘤抑制因子，Oct-4激活导致的E-cad下调或缺乏可诱导EMT，导致肿瘤细胞的侵袭和转移，影响LCSC的形成。除了物理上的低氧处理，化学低氧处理的方法也能够提高普通细胞的干细胞性。Wang等[11]发现，低氧模拟剂氯化钴可以提升A549细胞的肿瘤干细胞性。可见Oct-4作为缺氧刺激因子促进肺癌细胞去分化过程，并诱导LCSC的形成。

2.2 低氧诱导因子(HIF) HIF是一种具有转录活性的核蛋白，是由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β两个亚单位组成的异源二聚体，对于LCSC的功能具有调控作用。在缺氧条件下缺氧诱导因子HIF-1α与HIF-2α激活并维持LCSC的干细胞性，HIF上调SOX-2和Oct-4等干细胞基因获得多能性[12]。HIF激活下游基因促进肿瘤细胞的未分化状态，如HIF-2α所激活的原癌基因(c-Myc)是保证肿瘤干细胞始终处于未分化状态所必须的[13]。Sun等[14]发现，LCSC的形成常伴有HIF的升高，通过无血清培养筛选出具有干细胞性质的CD133+的A549细胞，其HIF-2α的表达水平明显高于CD133-细胞，HIF抑制剂FM19G11能够明显抑制LCSC干细胞标记物的上调和LCSC的成球能力。低氧加速了肿瘤的恶性转变，HIF的激活有利于维持LCSC干细胞活性，导致肿瘤组织耐药性的增强。Zhang等[15]发现，HIF在化疗诱导的LCSC中大量上调，并且与IL-6密切相关；其机制可能是IL-6通过转录控制HIF并且抑制HIF降解，增强LCSC的耐药能力。高表达HIF-2α的患者往往在临床上具有更差的临床分期和预后，HIF-2α的表达导致癌胚抗原在放疗后上升更快，患者的生存期更短。低氧是促进LCSC生成和分化的独立因素，可诱导出癌细胞的干细胞性，提升其药物抵抗，并且可导致更差的预后[16]。低氧作为肿瘤发展的必经之路，能够筛选有更强存活能力的LCSC，促进LCSC分泌更多的血管生成因子促进肿瘤的增殖和转移。

3 新生血管

肿瘤组织新生血管在肿瘤生长、转移和干细胞性维持等过程中起重要作用，血管不仅为肿瘤的生长提供营养，并且可为肿瘤转移提供许多有利条件[17]。在肿瘤生长初期，肿瘤组织无血管生成能力，主要通过炎症激活核因子NF-κB信号通路促进肿瘤血管生成，肿瘤巨噬细胞通过激活TGF-β、PDGF等细胞因子促进新生血管的形成。

3.1 内皮细胞 血管内皮细胞是血管组成的基本成分，尽管大多数构成血管的细胞来源于内皮细胞，但是一小部分构成血管的细胞可以由LCSC直接分化，从而促进肿瘤新生血管的形成。LCSC通过模拟肿瘤血管，分化为血管内皮细胞，或者直接作用于内皮细胞，诱导新生血管内皮细胞的形成[18]。血管内皮细胞表面存在特定的一组生长因子称为血管分泌因子，可以通过旁分泌方式促进LCSC的不断更新和分化，参与诱导维持体内平衡和代谢，因此LCSC常处于内皮细胞覆盖的成熟血管附近。Wang等[19]通过肺内皮细胞与肠道细胞共培养发现，肺内皮细胞能够刺激正常细胞中干细胞数量的比例，提高细胞中Nanog和Oct-4等干细胞标记蛋白的表达。另有研究发现，内皮细胞通过Oct-4促进肿瘤血管的新生。Gu等[20]研究发现，多能转录因子Oct-4的过表达足以诱导小鼠祖细胞的转化，这些转化的细胞不仅具有肿瘤发生和耐药潜能，还显著表达一些促血管生成因子，参与肿瘤血管生成。内皮细胞促进正常细胞转化为LCSC的机制很可能与胚胎干细胞基因Nanogp8的表达有关，内皮细胞通过旁分泌AKT诱导Nanogp8表达和干细胞球形成，调节细胞的表型和药物抵抗作用。可见LCSC能够分化为血管内皮细胞，而血管内皮细胞又能够促进LCSC的形成。

3.2 Dickkopf-1(DKK1) 血清DKK1是Dickkopfs家族成员之一，通过竞争性地结合Wnt蛋白的共同受体而阻断Wnt/β-catenin途径，是Wnt信号通路抑制剂。有多重分化和自我更新能力的间充质干细胞(MSCs)常常表达DKK1，使得LCSC周围血管新生，并致使LCSC细胞产生免疫豁免，避免免疫细胞对LCSC的攻击。DKK1不仅促进肿瘤周围血管的新生，还可以提升肿瘤细胞的干细胞性。Yao等[21]通过对28例具有新生血管的非小细胞肺癌患者检测发现，其LCSC相关蛋白CD44的表达升高，且与分泌型蛋白DKK1密切相关。DKK1促进了LCSC周围血管的新生，并且提升了普通肿瘤细胞的干细胞活性，通过下调LCSC中的DKKI，能够明显抑制肿瘤新生血管的生成以及LCSC标记物的表达。

虽然目前抗肿瘤血管药是LCSC治疗新方向，但如今抗肿瘤新生血管药物并不是十分完善。抗肿瘤血管生成药内皮他丁可以拮抗肿瘤新生血管的形成，但通过在移植瘤小鼠模型中使用内皮他丁，发现ALDH1+细胞在实体瘤中的比例增高。内皮他丁导致肿瘤组织缺氧，激活低氧基因如HIF-1α等，并吸引TAM、骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)、T细胞等免疫细胞产生大量的炎症介质，最终导致肿瘤组织中LCSC的形成[22]。肿瘤新生血管对于LCSC的作用日益受到重视，研究LCSC新生血管的机制有助于我们了解肿瘤转移、浸润等机制，为以后抗肿瘤药物的治疗和早期诊断提供指导。

4 细胞外基质

细胞外基质是由细胞分泌于细胞表面的大分子物质，主要由基底膜和细胞间基质组成。细胞外基质将细胞连为一个整体，决定细胞的形状，控制LCSC的分化与自我更新，并参与LCSC的增殖和侵袭。基质金属蛋白酶是最重要的一种细胞外基质降解酶，胶原蛋白是基质的重要成分，二者都参与LCSC的发病。

4.1 基质金属蛋白酶10(MMP-10) MMP-10是基质金属蛋白酶家族的成员，通过降解细胞外基质帮助肿瘤侵袭和转移。研究发现，MMP-10不仅与LCSC的干细胞性密切相关，并且对于LCSC的增殖能力必不可少。Justilien等[23]发现，MMP-10在人肺部肿瘤中大量表达，并且其高表达与人类肺癌的干细胞性和肿瘤转移特征相关，通过敲除小鼠LCSC的MMP-10导致LCSC干细胞标记基因表达、转移能力和自我更新能力下降，而加入外源性的MMP-10能够增强MMP-10敲除的LCSC细胞自我更新能力。MMP-10促进肿瘤组织的形成，维持LCSC高致瘤性和干细胞性。MMP-10的表达调控机制目前不清楚，有研究显示，MMP-10的激活与癌基因Kras基因相关。Regala等[24]研究发现，在肺腺癌小鼠模型中激活癌基因Kras导致MMP-10大量表达，而敲除小鼠体内的MMP-10后再次激活癌基因Kras则发现肿瘤数量和大小显著降低，表明Kras对于MMP-10诱导的LCSC形成中具有重要作用。

4.2 胶原蛋白 胶原蛋白是结缔组织的一种常见蛋白，大多由成纤维细胞分泌，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，是细胞基质的重要成分。胶原蛋白可以促进LCSC的干细胞性。Xu等[25]用3D胶原蛋白支架对肺癌细胞进行培养，在此培养系统中的肺癌细胞其LCSC相关基因如ALDH1、Oct-4、CD133表达水平增高，细胞转移能力和致瘤性增强，并且具有更强的耐药性。胶原蛋白不仅可以维持和提升普通肿瘤细胞的干细胞性，而且能够促进LCSC的转移和侵袭能力。Moilanen等[26]发现，LCSC中各种黏附分子表达增加，在这些分子中胶原蛋白(Col XVⅡ)被证明是维持LCSC中EMT和转移能力所必需的，Col ⅩⅤⅡ不仅促进细胞的恶性变化，临床研究还发现过表达Col ⅩⅤⅡ和层黏连蛋白-5的肺癌手术切除患者具有所有表达类型中最差的预后，通过阻断Col ⅩⅤⅡ/层黏连蛋白-5途径可降低LCSC体外EMT和转移能力。Col ⅩⅤⅡ和稳定的层黏连蛋白-5激活FAK/AKT/GSK3β抑制细胞内泛素化降解，其功能主要取决于ADAM9和ADAM10的脱落。细胞黏附是LCSC迁移的重要条件，一些细胞外基质成分能够维持LCSC干细胞性，改变LCSC表面的细胞外基质对于LCSC的诊断和治疗都具有积极作用。胶原蛋白作为干细胞的一个细胞外屏障，可以增强其耐药性，并且可以和很多细胞因子如TGF-β、VEGF、BMP等结合，调节LCSC的活性[27]。

微环境影响着LCSC的功能，对LCSC迁移、增殖以及耐药性都具有不可忽视的作用。近年来关于LCSC微环境的研究越来越受到重视，虽然人们对LCSC微环境的形成、发展和调控都做了进一步的探索，但目前人们对于LCSC微环境的认识不够全面。微环境对于LCSC的调控是一个复杂又动态的过程，了解微环境各种因素的功能有助于人们更清楚地认识肺癌，控制微环境因素可以为肺癌未来的诊断治疗提供新方向和手段。

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国家卫生和计划生育委员会行业专项(w2014GJ18)。

徐兴祥(E-mail： xuxx63@sina.com)

2017-06-27)