循环肿瘤细胞(CTC)生物学特性及其在胃癌中的研究进展

卢荣综述，陈强，施纯玫审校

(1、福建省肿瘤医院输血科，福建福州350001；2、福建医科大学附属协和医院肿瘤内科，福建福州350001)

·述评·

循环肿瘤细胞(CTC)生物学特性及其在胃癌中的研究进展

卢荣1综述，陈强2，施纯玫2审校

(1、福建省肿瘤医院输血科，福建福州350001；2、福建医科大学附属协和医院肿瘤内科，福建福州350001)

目前，外周血中循环肿瘤细胞（CTC）作为“液态活检”的主要研究对象，正成为癌症研究中最热门的领域之一。CTC被认为肿瘤侵袭的标志物，其检测方法也越来越被重视。CTC独特的分子特性能帮助我们更好的推断肿瘤转移情况，评估治疗疗效。本文综述了近年来关于CTC的生物学特性以及CTC在胃癌中的最新研究进展，并探讨了CTC在胃癌个体化治疗方面的应用及挑战。

循环肿瘤细胞(CTC)；胃癌；临床意义；生物学特性

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)是指由实体恶性肿瘤原发灶或者转移灶释放入血液循环系统的细胞[1]，是导致肿瘤转移及复发的重要因素。循环肿瘤细胞的检测是当下三种热门非侵入性液体活检方法中的一种[2]，因此检测外周血中的CTC具有重要临床意义。最新研究理论证实[3]，除了从已形成的实体瘤病灶（原发灶，转移灶）脱落入血外，肿瘤细胞在癌前病变的早期形成实体瘤病灶之前就有可能进入血液系统中，由此可提示循环肿瘤细胞的存在往往要早于影像学和临床症状的表现，因此相较于目前临床上传统肿瘤标志物监测和肿瘤的影像学检查，CTC能较早提示肿瘤的复发和转移。此外，部分肿瘤患者血液中还存在细胞团形式的CTC。CTC细胞团相比单个循环肿瘤细胞具有更强的转移潜能[4]和耐药性[5]，与预后的相关性也更强[6]。在肿瘤形成早期，CTC检测有助于鉴别肿瘤的良恶性，评估转移风险，为早期针对性治疗提供可能[7]；在进展期，CTC能帮助监测疗效，评价预后，其与肿瘤分期也有一定相关性；另外，有研究证实，CTC携带肿瘤遗传信息，可作为新型肿瘤标志物进行研究[8]。

1 CTC概述以及生物学特性

1.1 CTC的研究历史1869年，澳大利亚内科医生Thomas Ashworth在一名转移瘤死者的外周血上发现了循环肿瘤细胞（CTC），其能反映原发肿瘤的特性[9]。1889年英国病理学家Paget S提出了著名的“种子和土壤”假说（seed and soil hypothesis）[10]，提出了循环肿瘤细胞作为“种子”，在肿瘤发生、转移过程中起了重要的作用。但由于当时检测手段的限制，从外周血精确检测极低浓度的CTC是一个巨大的挑战，直到20世纪90年代中期开始探索捕获、分析CTC的方法并进行了大量临床试验，CTC的价值才被逐渐认识到。2004年至2008年美国FDA相继批准CellSearch技术用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的临床诊断[11-13]，2007年CTC又被美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）ASCO推荐为肿瘤标志物。随着现代肿瘤生物学研究的进展，尤其是检测技术的进步，CTC已成为肿瘤基础和临床研究的一个热点。

1.2 CTC的生物学特征与功能

1.2.1 CTC与肿瘤细胞的转移机制具有局部浸润和远处转移的能力是恶性肿瘤最重要的生物学特性，它是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因，也是临床治疗的难题。肿瘤的转移有两种假说，包括物理捕获假说[14]和黏附分子介导假说[15]，这两种假说是同时存在的，对立统一，共同促进肿瘤转移的研究与防治。肿瘤的转移是一个复杂的病理生理过程，经典的肿瘤转移经过原发灶肿瘤、肿瘤细胞播散入血并在外周血存活、局部细胞侵袭周围基质、运送至远端器官、形成转移灶等阶段[16]。而在这过程中，CTC在肿瘤转移与复发过程中发挥着重要的作用。早期的观念认为病情发生恶化或者进展的时候肿瘤才会发生转移，但目前越来越多的证据表明肿瘤的播散转移在早期肿瘤就可能出现，甚至某些时候可能在原发肿瘤形成之前就已经出现[3]。

1.2.2 CTC具有肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)特征CSC具有很强的自我更新以及分化能力，并具有致瘤能力和转移能力等特征[17]。2006年，Ponti D等提出了肿瘤起源于干细胞的理论[18]，该学说认为在大部分肿瘤细胞处于不增殖或有限增殖的状态，而具有干细胞特征(Stem Cell)的CTC，其才能不断地增殖分化，才是肿瘤产生、发展和治疗后复发的根源[18]。CSC形成有两种途径：一类是肿瘤自有的CSC细胞，CSC存在于肿瘤病灶发生的早期阶段，可能是正常组织干细胞或者祖细胞衍生而来。另一类是上皮间质转化（EMT）机制诱发形成的CSC细胞[19，20]。通过EMT作用，CTC可以转变成具有转移能力的循环肿瘤干细胞[21]。一项对1439例乳腺癌患者外周血中CTC样本的研究显示，35.2%的CTC存在CD44+/CD24－/low肿瘤干细胞表型，17.7%的CTC存在ALDH1 high/CD24－/low干细胞表型[22]，提示肿瘤干细胞样CTC可能是形成转移灶的重要成分。

1.3 CTC与转移灶形成循环系统中检测出CTC并不一定意味着患者已经发生转移或已经复发。肿瘤转移是个相对复杂的过程。肿瘤患者外周血中获得的CTC半衰期大约为1~2.4h[23]。因其存活时间较短，加上大部分侵入血液CTC会遭到如血流剪切力等物理方面的破坏以及自身免疫细胞的杀伤吞噬作用，所以只有极少数CTC能够存活下来。幸存的CTC利用细胞表面的组织因子吸引血小板，此外，通过结合P选择素受体，肿瘤细胞也可诱导血小板的聚集[24]，然后形成被血小板包被的混合细胞簇，因为有了血小板外壳的“保护”作用，免疫杀伤细胞无法识别肿瘤细胞表面抗原从而逃脱免疫监视[25]。

少数的CTC在外周血存活下来后，在中性粒细胞及单核巨噬细胞的帮助下，与血管内皮细胞建立初始联系。而外周血中的CTC穿透基底膜后，可以通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等，刺激细胞膜基质旁的新生血管形成[26]。一旦到达目标器官，CTC会引起肿瘤细胞发生EMT，EMT过程中肿瘤细胞会下调上皮组织特定标记物如上皮细胞黏附分子（EpCAM）和角蛋白（cytokeratin，CK）[27]的表达，上调间叶组织标记物如波形蛋白（Vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达[28]。这样就抑制了更多的内皮表型表达[29]，增强CTC的外侵及播散能力，当CTC到达转移靶器官后，再经过间质上皮转化（MET）的逆转化，继续增殖进而形成肿瘤转移灶。所以，肿瘤细胞脱落入血并在外周血中存活以及外侵转移受细胞本身和微环境的多重因素影响和调控，包括血小板-CTC、肿瘤细胞-内皮细胞、单核巨噬细胞-内皮细胞之间的相互调控。

具有干细胞特征的CTC细胞团，它们之间不是由单个CTC在血管内增殖形成，而是通过斑珠蛋白互相之间抱团，由2~50个CTC组成，形成循环肿瘤细胞团（CTC clusters）[6]。有CSC特征的CTC细胞团在远端组织重新开始肿瘤生长，这些转移称为隐匿转移或微小转移，因为CSC的异质性很强，每个细胞的基因组都是不一样，所以该转移灶很容易逃避免疫系统的识别，并能够在完全不同于原位肿瘤的微环境中存活，这样肿瘤的远处转移才可能发生[30，31]。相比于以单个细胞状态存在的CTC，CTC细胞团引起远处转移的能力是CTC单个细胞的23-50倍，占了远处转移病灶的一半。

2 CTC在胃癌的应用进展

胃癌是起源于胃壁最表层的黏膜上皮细胞，是最常见恶性肿瘤之一。我国的发病率则明显高于全球平均水平，全球每年新发胃癌100余万例，死亡约80万例，在全球肿瘤死亡中排名第二位[32]，根治性手术是目前胃癌的主要治疗手段，其5年生存率仅为40%左右，其中腹腔内转移是进展期胃癌最常见的转移方式和致死原因[33]。由于胃癌患者无特异性的早期症状，70%的胃癌患者在被诊断时已经发展到进展期（Ⅲ、Ⅳ期），预后较差。胃癌的诊断主要依靠影像学和血液肿瘤标志物的检测，灵敏度不高，缺乏有效的生物学检测指标，并且目前评价辅助治疗疗效主要依靠无进展生存时间（Progress Free Survival，PFS）、总生存期（Overall survival，OS)等，无法实时监测疗效。而疗效评判的不准确性不仅可能导致患者过多接受无效治疗并承受相应的毒副反应，还可能导致患者过早的停用有效的治疗方案，均不利于胃癌患者的治疗。而CTC具有无创性和简便性的优点，是近年提出的“液态活检”的研究对象之一，在肿瘤诊断、治疗、预后及个性化治疗中具有极大应用价值，可为临床治疗策略的选择提供了可靠的依据，起到很好的动态监测作用。

2．1 CTC对分期的补充TNM分期是由国际抗癌联盟（UICC）/美国癌症联合委员会(AJCC，American Joint Committee on Cancer)提出的肿瘤分期系统，是目前最为通用的实体肿瘤分期系统，但该系统在预测肿瘤转移和复发方面准确率不够，因此需要更敏感的预测指标。而CTC可以作为TNM分期的重要补充。2007年CTC被美国临床肿瘤学会（ASCO）推荐作为乳腺癌的肿瘤标志物[34]。20122010年AJCC也重新修订了乳腺癌的TNM分期标准，将“缺乏临床或影像学证据证实的远处转移、但在外周循环、骨髓或其他远处组织内非区域淋巴结通过分子生物学或显微镜观察确定存在的、小于0．2mm的转移病灶定位cM（i+）cM0（i+）期”，体现了CTC的重要临床意义。而在胃癌方面，由于胃癌缺乏CTC的特异性基因，相关报道还比较有限，但Cao W等[35]通过检测Suivivin基因表来检测胃癌术后患者外周血CTC时发现，CTC的数量与肿瘤的分期具有相关性，CTC在进展期胃癌（Ⅲ～Ⅳ期）中检出率明显比Ⅰ～Ⅱ高，对胃癌的临床分期参考提供了一个新的思路。

2．2 CTC在胃癌疗效评估方面的价值化疗是胃癌治疗的主要手段之一，对化疗方案或者新化疗药物的评价目前主要依靠影像学检查，然而，原发灶肿瘤细胞和转移灶的肿瘤细胞存在异质性[36]。有些化疗方案或药物对原发灶有效，对转移灶可能无效，此时应用常规检查手段难以做出准确判断，特别是微转移灶。CTC与胃癌的转移密切相关，因此CTC检测可以间接反映转移灶肿瘤细胞对化疗药物的反应，化疗前后的检测可以从细胞水平对化疗方案或药物疗效进行评价[5]。在化疗疗效评估上，CTC检测不仅比影像学检查更早提示治疗效果，而且可以实时评估化疗疗效[37]。CTC检测的应用为及时评估疗效及病情提供了新思路。Matsusaka S等[38]发现进展期胃癌患者接受替吉奥方案单次化疗2周及4周后外周血中的CTC数量明显降低，其中以化疗两周后降低最明显。Lee SJ等[39]还发现在转移性胃癌的患者中CTC阳性的病人化疗疗效以及反应性均不如CTC阴性的患者。因此，定期检测CTC数目可指导临床上化疗药物的使用，CTC的减少是治疗有效的早期指标。

2．3 CTC对预后及复发风险判断的价值目前越来越多的研究致力于寻找能评估肿瘤预后的有效指标，以期影响临床决策，提高患者生存质量。一些研究表明，CTC的检测对于评估胃癌的预后有潜在应用价值。Ikeguchi M等[40]的研究比较了胃癌患者术后2d内CTC阳性情况和预后的关系，结果显示CTC阳性患者的复发率高于阴性患者。Matsusaka S等[38]人则发现CTC≥4组的进展期胃癌化疗病人总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）要显著小于CTC＜4组。而在进展期胃癌和胃食管腺癌方面，Kubisch I等[41]研究CTC阳性患者OS和PFS均较CTC阴性病人明显缩短（阳性患者PFS 3．5个月、OS 5．8个月对比阴性患者PFS 10．7月、OS 13．3个月）；Arigami T等[42]在2013年通过斯钙素－2的表达检测胃癌外周血CTC，也发现CTC阳性患者的OS较CTC阴性患者明显缩短。Hiraiwa K等[43]使用Cellsearch系统检测44例胃癌患者的CTC水平，发现CTC检测数＜2的患者OS明显高于CTC≥2的患者，并且转移性胃癌的CTC阳性率高达61%，较非转移性胃癌患者明显升高。Zou K等[44]对16个胃癌的研究进行Meta分析得出CTC检测数越少的拥有更好的PFS（风险比HR=2．02）和OS（HR=2．23），而且其数值还与肿瘤浸润深度、局部淋巴结转移和肿瘤远处转移等成正相关。这些就提示CTC可作为胃癌判断预后及复发的检测指标。

2．4个体化治疗的指导以个人基因信息为基础的个体化治疗，也称精准治疗已经成为当下肿瘤治疗的新趋势。从患者外周血中分离的CTC携带了肿瘤的全部基因信息，可以用于开展免疫荧光原位杂交、荧光定量PCR和二代测序实验，用于检测基因的表达、突变、融合或拷贝数，为精准治疗提供重要个体化信息参考[45，46]。CTC检测这种无创液体活检技术对于不便获得肿瘤组织样本的患者意义尤为重大，并且可以实现动态监控，更精确的指导临床用药。

曲妥珠单抗是人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER－2)的靶向药，曲妥珠单抗联合化疗可显著延长HER－2阳性晚期胃癌患者的生存期，但由于胃酸和消化酶的影响，胃癌组织HER－2的检测常常出现假阴性，给胃癌的靶向治疗带来困难。而CTC的出现，就可通过检测CTC中HER－2的表达状态，进而行靶向治疗的选择[38]。这也为肿瘤的化疗提供了新的思路，也为CTC的应用提供了新的理论支持。

3 小结和展望

指导胃癌进行个体化治疗是目前胃癌研究领域的热点，而取得具有代表性的胃癌标本，对其生物特性进行检测和研究是诊断和治疗胃癌的基础。虽然现在CTC在胃癌方面的应用面临着诸多挑战。如胃癌涉及紧密的主要有人端粒酶反转录酶（hTERT)，人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)、CEA和黏蛋白1（MUC1）等[47-49]CK以及EpCAM含量不高，所以其固有的高假阴性率限制了该领域的进一步发展；CTC的检测费用昂贵；CTC与胃癌相关事件的大规模、前瞻性、多中心临床随机试验研究尚不多；其在胃癌领域的研究都尚处于摇篮时期，但潜在的实用价值已初见端倪。随着研究的深入，CTC在临床中的应用会进一步提高早期诊断率、更准确判断疗效、评估预后及判断复发指导、指导精确的个体化治疗，从实验室到临床的成功转化最终使广大胃癌患者受益。今天我们所面临的每一个挑战最终都会加深我们对CTC的认识，也必定会为CTC检测更好地应用于临床铺平道路。随着技术手段的突飞猛进，CTC检测分离技术最终会走向成熟，利用外周血循环肿瘤细胞进行胃癌的“液相活检”也终将成为现实。

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R735.2，R730.43

A

1674-1129(2017)02-0135-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.001

2016-11-08；

2017-03-18)

福建省自然基金卫生联合资金项目，编号：2015J01397

卢荣，男，1983年生，学士学位，在读研究生，检验技师，研究方向：肿瘤学等。

陈强，教授，博士生导师，E-mail：cqiang8@189.cn；施纯玫，副教授，硕导。