他克莫司对肝脏缺血/再灌注损伤作用的研究进展

陈峰，王建，张雅敏，刘子荣（.天津医科大学一中心临床学院, 天津 3009；. 天津市第一中心医院肝胆外科，天津市器官移植临床医学研究中心, 天津 3009）

肝移植是当前解决肝脏晚期病变、肝外伤、肝衰竭等急重症肝脏疾病的唯一有效方法［1］。临床上的移植肝需要经历热缺血、冷灌注、低温保存、复温、缺血/再灌注等多个环节，而每一环节都可能对移植肝造成不同程度的损伤［2］。其中，肝脏的缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是主要的。它能够降低肝脏的解毒作用，阻碍微循环，严重者可导致肝功能衰竭，直接影响预后情况。因此，关于减少供肝IRI的研究显得尤为重要。他克莫司（FK506）作为一种免疫抑制剂在肝脏IRI中起重要的保护作用［3］。FK506能防止肝脏缺血/再灌注损伤期肝细胞内钙超载，减轻氧自由基及脂质过氧化作用，维持三磷酸腺苷（triphosadenine， ATP）含量、保护细胞膜等功能。尽管当前关于FK506对肝脏缺血/再灌注作用的研究越来越多，但仍缺乏系统的认识。

1 FK506的作用机制

FK506是从筑波链霉菌发酵液中提取的大环内酯类免疫抑制剂［4］，1994年被美国食品和药物管 理 局（Food and Drug Administration， FDA） 批准用于实体器官移植。FK506是一种高度亲脂性的化合物，很容易穿过细胞膜进入细胞［5］。胞浆中含有的钙调磷酸酶能够使活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells， NFAT）的细胞质亚单位去磷酸化，从而使其向细胞核内易位并且与核亚单位结合，形成的复合物可与多种细胞因子如白细胞介素-2（interleukin，IL-2）基因的启动子结合，从而上调后者的转录，而进入细胞的FK506与FK506结合蛋白形成的复合物能够抑制钙调磷酸酶的活性，从而抑制细胞因子基因的转录，影响细胞因子IL-2、IL-3、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、γ-干 扰 素（interferon-γ，INF-γ）等的表达［4，6］。这在一定程度上保护了移植的肝脏，有利于其术后功能恢复。

2 肝脏IRI与FK506的应用

在肝脏移植过程中，细胞及分子水平结构、功能的改变触发了细胞损伤，而研究发现FK506在肝脏中的应用对IRI具有一定的抑制功效。

2.1 钙超载：肝脏在缺血过程中，氧化磷酸化作用的减少导致ATP缺乏，而依赖ATP进行的钙离子跨膜主动转运受到影响，导致细胞钙离子超载，扰乱了钙稳态［7］；缺血的同时引起肝细胞缺氧导致线粒体去能、钠离子和氢离子稳态改变，进而使肝血窦内皮细胞和库普弗细胞（kupffer cells， KC）肿胀［8］。前期研究发现，肝缺血前给予FK506处理能够抑制线粒体内钙离子的浓度，维持其功能并调控引发炎症通路的酶系统，降低肝脏的损伤［9］。而在全肝缺血/再灌注模型中发现，FK506可能通过提高线粒体呼吸作用、氧化磷酸化作用和抗氧化性能或者抑制钙离子超载而减轻心肌线粒体的功能障碍［10］。这表明FK506对线粒体相关功能的作用有助于器官的保护。

2.2 微循环障碍：微循环障碍的发生可以由一氧化氮（NO）和血管紧张素（ET）之间的失平衡引起［8，11］。在肝脏缺血/再灌注过程中，ET浓度的增高导致血管收缩肝窦状隙变窄，血流淤滞，继而损伤肝细胞。Soda等［12］的研究显示，FK506对内皮细胞中的血管收缩物质（ET-1）的表达有直接影响，可能改善肝脏微循环。而NO参与血流动力学和微循环的改变，能够扩张微血管，减轻中性粒细胞的聚集，改善肝脏微循环，降低肝脏损伤［13］。因此，肝脏局部缺血预处理的保护作用可能存在内源性NO调节作用［14-17］。这与使用CD47单克隆抗体阻断CD47对NO信号通路抑制的实验中［18］，发现此抗体应用后能够减弱移植肝的IRI，保护肝功能并提高受体存活率的结果相符。有研究发现，FK506对体外培养的内皮细胞进行处理后，ET-1含量明显增加而NO含量没有明显改变［19］。但低剂量FK506联合NO抑制剂（AGH）处理移植肝，术后3天丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平明显低于单用FK506组，而且术后第5、8、10天组织检查发现，联合应用组几乎没有淋巴细胞浸润。该实验结果表明，两者联合应用可以减少浸润的炎症细胞、诱导缺血耐受，同时对大鼠肝移植进行联合双重药物处理有预防的效果［20］。

2.3 氧自由基、细胞因子及中性粒细胞之间的作用：活化的KC释放活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）和促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-1等［21-22］。而活化的内皮细胞和肝细胞可以通过线粒体和黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶（XDH /XOD）途径产生ROS［23-24］。细胞因子促进中性粒细胞的活化和聚集，从而有助于释放的活性氧和蛋白酶损伤肝实质［21，25］。毛细血管收缩也有助于肝脏中性粒细胞的聚集［26］。此外，细胞因子IL-1β和TNF-α可以募集并激活CD4+T淋巴细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor， GM-CSF）、γ-IFN，这些细胞因子进一步促进KC活化、TNF-α和IL-1分泌、中性粒细胞募集和黏附入肝血窦［27］。这与贺凯等［28］研究发现的在肝脏缺血/再灌注早期CD4+T淋巴细胞先于中性粒细胞进入缺血区，并可能对中性粒细胞浸润产生调节作用是一致的。血小板活化因子为中性粒细胞ROS产生做好准备，而白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）有助于中性粒细胞反应的放大［21，25］。

促炎细胞因子的分泌激活了机体免疫系统，而FK506对促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌有较强的抑制作用，发挥了免疫抑制功能；同时对GM-CSF也有明显的抑制效果，降低了中性粒细胞的产生，减轻了移植物的炎症损伤［29］。魏思东等［30］研究发现，FK506组中肝脏糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocor-ticoid-induced TNF receptor，GITRL）的表达水平明显降低，而抗炎细胞因子IL-10含量升高。说明在肝脏移植中FK506抑制了GITRL的表达，加强了免疫耐受。由于GITRL具有促进T细胞增殖和激活的效应，FK506可以通过抑制GITRL的表达来减轻肝移植排斥反应。另外，肝移植患者经FK506治疗后，CD4+T细胞水平明显降低，由此而诱导的细胞因子表达水平降低，并抑制T细胞免疫排斥反应［31］。

2.4 抗氧化剂：移植物中抗氧化剂的水平与其损伤有关。在肝细胞缺血缺氧阶段，内源性的抗氧化剂如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）会失活或耗尽，超氧化物的清除减少［32］。这与研究发现肝移植物中抗氧化剂SOD的过表达、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的预处理都可降低其损伤，提高成活率是一致的［33］。

在对预处理的肝脏进行再灌注2小时后，FK506（10 ng/ml）组导致血浆ALT含量降低，还原型谷胱甘肽的氧化产物（GSSG）的含量显著降低，而内源性细胞内的GSH的浓度没有变化。相对应的，再灌注后GSSG的胆汁浓度及血浆中的含量明显增加。这表明当FK506作为移植肝的冲洗液时，会通过一个未知的通路来影响缺血后GSH的代谢［34］。ROS水平的增加是已知的能参与缺血/再灌注损伤的发病机制之一。FK506在体内的应用与减少ROS相关［35］。一种可能的作用机制是ROS通过维持细胞质和细胞外GSH/GSSG发挥解毒作用。该现象很可能是由FK506在肝细胞中抗氧化作用导致的。这与Pratschke等［34］的研究结果相符，即肝细胞100%的吸收了应用剂量为10 ng/ml的FK506。

2.5 信号通路的激活：IRI启动内质网蛋白质的错误折叠，后者激活一个高度保守的未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）信号转导通路。而保守的UPR激活需要肌醇需要酶1、PKR样ER激酶（PERK）和激活转录因子（ATF-6）3个内质网跨膜蛋白来协同完成。如果损坏非常严重，不能恢复平衡，内质网应激信号转导通路就会引发细胞的凋亡和坏死［33］。

在肝脏缺血损伤中，Toll样受体4（toll like receptor-4， TLR4）信号通路同样起到了一定的作用。Ellett等［36］用敲除TLR4的动物进行实验，发现TLR4的缺失减少了促炎因子释放及肝脏损伤。而通路中髓样分化的初级反应基因88和TIR结构域接头分子诱导INF-β激活细胞内信号传导，最终引发炎症反应［33，37］。Kilinc等［38］研究发现，与对照组相比，术前给予FK506处理的供体大鼠缺血/再灌注后早期TLR4的表达水平显著地降低。

2.6 炎症反应：研究发现FK506的浓度和剂量比值与肝移植受体IL-18和IFN-γ有关，IL-18或IFN-γ在血清中含量高，则FK506的浓度与剂量比值低。而在IL-18含量高的实验组，其移植肝功能障碍的发生率也高。这是基于IL-18上调P-糖蛋白（P-gP）的结果［39］。在另一个实验中，同种异体移植炎症因子-1（allograft inflammatory factor-1，AIF-1）的mRNA、蛋白质及诱导物IFN-γ、IL-1β在IRI的原位移植和同种异体移植排斥模型中显著增加。而AIF-1在炎症和免疫过程中发挥作用，其活化与肝脏的损伤有关联。该实验表明经低剂量的FK506预处理后，部分抑制AIF-1活化及其诱导物IFN-γ、IL-1β并减少热缺血及冷IRI［40］。另外，研究中发现AIF-1被抑制的原因可能是其诱导物被抑制的结果。因为FK506在活体能够抑制IFN-g和IL-1b的上调，但在应用IFN-g和IL-1b刺激的大鼠巨噬细胞中却无限制AIF-1上调的作用。因此，FK506不会对巨噬细胞产生直接作用，而有可能是淋巴细胞［40］。Kristo等［41］的研究同样发现FK506具有抗炎性能，对移植肝进行灌洗能减少前炎症酶前体的产生并能够在全基因组基础上抑制炎症和免疫反应。

2.7 肝功能的保护：白三烯受体拮抗剂（ONO-4057）联合FK506在大鼠肝移植模型中进行研究，发现术后血清转氨酶水平低于单独应用FK506组。而单用ONO-4057却没有减少IRI，这说明其预处理对FK506的保护功能有额外的作用［42］。另外，王东等［43］研究发现，FK506能在一定程度上保护脂肪肝供体大鼠肝移植围术期移植物的功能。在临床前期的动物模型中发现FTY720与亚治疗剂量的FK506联合应用能够有效地预防移植术后急性排斥反应的发生，并明显减少FK506可能造成的肝肾毒性［44］。

初步的临床数据表明，FK506预处理在人类肝移植表现出不同的效果。在一实验中，Peter等［45］用20 ng/ml FK506门静脉给药对早期肝功能产生有益效果，显著降低了肝移植术后转氨酶水平。但在另一项随机对照试验中，Kristo等［41］发现FK506经门静脉给药处理，术后第6天ALT、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase， AST）含量与对照组相比未有降低。

2.8 T细胞：自然杀伤T细胞（natural killer T cell， NKT）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）对循环肝细胞有毒性作用，并因此抑制肝脏再生［46-47］。在经历肝部分切除的小鼠模型中，FK506可以抑制NKT细胞的扩散［48］。而在另一项研究中发现：① 实验组中FK506降低了NK细胞在肝脏的浸润；② FK506与雷帕霉素联合应用在肝缺血/再灌注中的保护作用是伴随着肝脏T淋巴细胞的减少和淋巴细胞亚群相对比例的复合变化而完成的［49］。该实验表明此作用不仅是主效应细胞的减少，而且还有Th1/Th2早期的降低和调节性T淋巴细胞的逐渐增加。这与之前发现的Th1抑制Th2的活化来加速移植排斥和Th2 抑制Th1来诱导移植物被接受的作用相符合［50］。在缺血/再灌注的大鼠组，FK506还增强了循环细胞的比例。另外，实验表明尽管信号通路不同，但以共同的方式改变了早期局部免疫反应［49］。Tamura等［51］研究发现免疫抑制剂FTY720与FK506联合应用于鼠肝移植模型可以显著减少移植肝的淋巴细胞浸润，并且肝组织结构没有明显的变化。

2.9 细胞凋亡：再灌注期间，TNF-α和其他介质活化了与细胞凋亡相关的蛋白，如caspase-3 、caspase-8及释放入胞质的线粒体细胞色素c，导致DNA的破坏和细胞凋亡［27］。而肝细胞的凋亡破坏了细胞保护屏障。FK506处理的大鼠脂肪肝在缺血/再灌注后坏死细胞明显减少，而凋亡细胞数量增加了，同时防止了ATP含量的降低。但在对照组测得细胞凋亡数量和ATP含量明显降低，而坏死细胞数量增加［52］。该实验说明FK506通过防止ATP的损耗来保护脂肪肝对抗IRI。

TNF超家族成员的受体CD40的活化会通过FasL的表达介导Fas诱导的人肝细胞凋亡，而器官移植时，低氧会增加FasL的表达引发肝损伤［53］。在大鼠肝移植模型中发现，FK506通过对Fas表达的下调和Bcl-2表达的上调发挥抗细胞凋亡作用［54］。同样，Gómez-Lechón等［55］研究发现，FK506在体外可阻止Fas诱导的人肝细胞凋亡，从而维持细胞保护屏障的完整性。

2.10 热休克蛋白：热休克蛋白（heart shock protein， HSP），在肝脏缺血/再灌注中被诱导表达，虽然有关研究发现其出现的时间、变化的规律和分布有所不同，但都表明与肝脏IRI的发生、发展有关。它能调整应激过程中细胞的存活能力，保护细胞免受损伤，有利于细胞结构和功能的恢复，进而维持内坏境的稳定。HSPs对肝脏保护作用的机制主要有调控炎症因子的表达、抑制中性粒细胞浸润、抗细胞凋亡和抗氧化作用［56］。而伴随HSP70表达增加的转基因小鼠同样证实不容易遭受缺血损伤。前期的研究已表明，在培养的肝细胞中FK506能够增强HSP70诱导型的表达［9］。但HSP70在临床应用的研究报道尚少。所以，具有保护性能并可被FK506诱导产生的HSP70在人肝脏缺血/再灌注中的作用需要进一步研究。

2.11 核转录因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）：NF-κB是一种调节许多基因表达的可诱导的核转录因子。在肝脏热缺血和冷缺血过程的急性损伤反应中发挥了多种作用。在KC中，活化的NF-κB通过细胞因子表达的增强加重了缺血/再灌注肝脏的炎症反应和损伤，而在肝细胞中NF-κB却起到了细胞保护作用［57］。这种作用在其他实验中被证实，NF-κB受体激活剂（RANK）及它的配体（RANKL）相互作用提高了NF-κB的活化，减弱了肝脏的IRI［58］。而前期实验研究表明FK506能够阻断NF-κB的早期活化［9］。

2.12 血小板活化：肝脏的IRI刺激了KC和中性粒细胞的活化，而活化的中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶并黏附于肝血窦内皮细胞。而血小板也参与了肝脏IRI，其在肝血窦的黏附导致了再灌注后肝功能障碍。二者协同加剧肝窦内皮细胞凋亡［59］。该实验证明了于缺血/再灌注后显著增加的血小板黏附是中性粒细胞诱导的而不是KC。但另一实验发现缺血/再灌注后，肝血窦内KC数量的减少降低了黏附于血小板的KC数量，并导致KC和血小板之间相互作用的减弱［60］。说明KC-血小板间的相互作用与KC数量有关。另外，活化的血小板可以通过分泌功能性的CD154来诱导ROS集聚在肝细胞内引起凋亡［53］。

近几年的研究发现，临床上应用FK506会出现血小板减少的现象。但在体外进行FK506对血小板功能影响的实验表明，当前治疗剂量的FK506不会直接引起人血小板的凋亡或活化，但其对血小板聚集功能有一定的影响，可能会间接加重器官移植后血小板的局部聚集［61］。

2.13 肝再生：对应用FK506预处理的大鼠实施70%肝切后，进行再生肝细胞分裂指数等检测，发现与对照组相比明显升高［62］。同样，70%肝切并伴有门脉狭窄的鼠肝给予FK506处理，与未用药对照组相比测得：剩余肝脏重量显著增加，核分裂指数较高，肝再生所需的IL-6表达明显增加［63］。以上结果表明，FK506具有促进肝脏再生的能力。然而，Lodewijk等［64］的实验发现，在肝脏再生期间他克莫司的新陈代谢会被抑制。这是因为肝移植应用的许多免疫抑制药物是通过细胞色素P450-3A4系统进行新陈代新的，而肝脏再生是与下调细胞色素P450-3A4系统相关的。所以，肝再生与FK506的应用存在一定的矛盾。这也正是FK506治疗窗狭窄的体现。

3 结语和展望

缺血/再灌注对肝脏会产生多重的病理生理学反应，造成其不同程度的损伤。包括氧化磷酸化作用减少导致ATP的耗竭，钙离子超载，ROS、促炎介质的形成，巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的募集和活化，细胞因子的释放及微循环障碍等。因此，在移植后很难达到理想的保护效果，而最近的研究发现FK506或与其他药物联合的应用对移植肝的干预或预处理具有许多优势，如减少缺血造成的细胞损伤，降低术后血清转氨酶的含量，促进移植肝术后肝功能的恢复等。

尽管关于FK506的动物实验及临床研究对IRI的作用取得了不少进展，但目前对FK506的肝保护作用仍缺乏明确的认识，一些实验结果尚存在相互矛盾之处，并且肝脏IRI是多因素复合反应的结果。因此，免疫抑制剂FK506对移植肝进行预处理或干预治疗从而减少缺血/再灌注造成损伤的潜在治疗作用及可能的不良反应仍需进一步的研究。