干细胞示踪技术在动物实验中的应用及进展

曹欢，宋红丽，沈中阳（. 天津医科大学一中心临床学院，天津 300070，.天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 3009）

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞［1］。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官的潜能，这些特性是干细胞治疗的基础［2］。近年来，干细胞移植治疗已在动物模型和部分临床试验中取得了巨大进步［3］。为了实现干细胞的治疗潜力，干细胞必须在移植后迁移到损伤或病变部位，分化为靶细胞然后定植于病变部位并存活［4］。

随着细胞示踪及成像技术的发展，研究者能更加深入地了解干细胞在动物模型体内的迁徙、存活及分化情况［5］。为了更好地了解干细胞在机体的情况，合理的示踪技术起着至关重要的作用。本文将比较各种示踪技术的优缺点，并对目前示踪技术的研究进展进行综述。

1 干细胞的标记及示踪技术

1.1 荧光蛋白标记示踪法：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）是由 Shimomura 等［6］在1962年从一种学名为Aequorea victoria的水母中发现的由238个氨基酸组成的单体蛋白质。随后相继发现了30余种波长不同的荧光蛋白，常见的有GFP和其衍生物黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein， YFP）、 蓝 色 荧 光 蛋 白（blue fluorescent protein， BFP）以及红色荧光蛋白（red fluorescent protein， RFP）等。

荧光蛋白示踪的原理是通过腺病毒、慢病毒、质粒等载体将荧光蛋白基因与目的基因整合并在宿主细胞内表达，经激发光照射下发出荧光。现主要介绍最常用的GFP和RFP，以及最新研究进展迅速的新型荧光蛋白。

GFP具有如下优点：① 不需加入任何底物或酶即可发射稳定的绿色荧光，可显微镜下观测活细胞的情况［7］，也可与其他荧光试剂同时进行双标实验或同时联合多种荧光蛋白在同一组织中不同的靶细胞［8］；② 对细胞和机体的毒性作用和不良反应小，对细胞的完整性及活力影响小［9］；③ 荧光蛋白质无种属特异性，原核和真核细胞均能表达［10］；④ 可以进行定量研究［11］。GFP目前已成为动物实验中示踪完整活细胞生命现象的重要手段。然而，GFP在作为示踪剂时仍存在一些不足：① GFP的表达水平在个体之间甚至在同一动物体内的不同细胞中是高度可变的，移植前高水平表达GFP的细胞移植后可能会出现低表达［12］；② GFP的具体半衰期还不确定，不利于在实验中对时间的掌控；③ 在发光效率方面，野生型GFP发光强度和灵敏度较低［13］。为了解决上述问题，目前使用较多的是其人工突变体增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）。EGFP增强了GFP的荧光性能，显著提高了检测灵敏度。有研究人员使用EGFP转染骨髓间充质干细胞，实现了体外培养6个月荧光持续稳定表达［14］。

RFP也是一种常用的荧光蛋白，光稳定性高，并且受pH值影响小，在pH为5～12范围内吸收光和发射光强度没有明显变化［15］。其优点与GFP大致相同，荧光强度较GFP稍强，并且RFP能发射更长的波，能够渗透至深部组织。但是其细胞毒性比GFP高，故单独运用时使用频率比GFP低，其与EGFP形成互补，共同用于双色荧光示踪。

上述传统荧光蛋白荧光的成熟依赖于氧分子，在用于研究高密度发酵、脑缺血、肿瘤缺氧等厌氧生物系统的作用有限［16］。为了解决上述问题开发的基于黄素的荧光白（flavin-based fluorescent proteins， FbFPs）是一种新型荧光蛋白，其特征为不依赖氧成熟的荧光，并且与GFP相比，FbFPs分子量更小［17］，适用于在低氧条件下示踪靶细胞或厌氧微生物［18］。

1.2 荧光染料标记示踪法：迄今为止，多种荧光染料已被利用于标记示踪干细胞，不同的荧光染料可与细胞的不同部位可逆或不可逆地结合，如可以结合细胞核的荧光染料：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、双苯甲酰亚胺（Hoechst），结合细胞膜例如碳花青染类料（DiI）等，位于细胞核、细胞膜和细胞质的如羧基荧光素琥珀酰亚胺基氨基酯（CFSE）等［19］。其原理是：干细胞移植前，使用荧光素进行预先标记，移植后利用荧光显微镜观察荧光标记干细胞的迁徙情况及后续的存活情况。染料能直接标记细胞，适用于短时期示踪，因染料不是基因依赖，不能遗传给子细胞，随着细胞的增殖过程，被标记的细胞会越来越少，只能用于短时间观察［20］，现介绍氯甲基苯甲酰氨（chloromethylbenzamidodialkyl carbocyanine，CM-DiI）和 DAPI两种具有代表性的荧光染料。

CM-DiI是一种亲脂性碳花青染料，易嵌入细胞膜磷脂双分子层作侧向扩散运动而标记整个细胞膜，是一种细胞膜荧光染料，其在醛类物质中保持稳定，因此CM-DiI标记细胞后再进行固定、脱水、浸蜡及包埋等操作不会影响其荧光［21］。因其标记率高，具有标记细胞后传代示踪的可行性，适用于观察细胞在体外的诱导分化情况，或显示移植细胞在活组织的迁徙及分化［22］。研究表明，在保证良好的标记示踪的前提下，CM-DiI的常用浓度为 4 ～ 10 μmol/L［23］。CM-DiI具有以下缺点 ：① CM-DiI虽然细胞毒性低，在常用浓度标记细胞时，对标记后细胞成活率影响不大,但是对细胞早期增殖有影响［24］；② 由于CM-DiI 标记的产生荧光存在于细胞膜和细胞质，不存在于细胞核，传代培养后荧光有所衰减，不能用于干细胞的长期示踪，适用于短期示踪［25］。

DAPI可以透过完整的细胞膜，快速进入活细胞中与DNA结合，在紫外光的激发下呈蓝色荧光，DAPI对细胞活性、增殖均无明显影响，是较为常用的细胞核荧光染料［26］。用DAPI标记的骨髓间充质干细胞，荧光显微镜下观察，12小时即可见细胞核发明亮蓝色荧光，但随着标记时间的延长，荧光亮度和标记率均逐渐降低，以12～24小时为最佳标记时间［27］。DAPI的缺点是随着细胞的分裂增殖，DAPI被平均分配到子代细胞中，导致DAPI标记强度降低，灵敏度下降。更重要的是，DAPI无法与DNA共价紧密结合，因此，细胞移植后DAPI可从标记的细胞上解离，并被宿主细胞摄取［28］，因此，DAPI不是活细胞的理想标记物，多用于细胞凋亡检测或短期的标记示踪。

1.3 核酸标记法：具有代表性的是5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），为一种嘧啶类似物，常用于标记活细胞中新合成的DNA。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示［29］。但是BrdU需要变性DNA后才能与抗体结合，破坏了DNA双链结构，导致染色弥散，准确性降低等问题，逐渐被5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU） 取 代［30］。EdU是另外一种胸腺嘧啶核苷类似物，它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况［31］。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性即可有效检测，可有效避免样品损伤，适用于在细胞和组织水平能准确地反映细胞增殖等现象。

1.4 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）：FISH是基于DNA或DNA / RNA双链的互补性质的大分子识别技术。与荧光团偶联的核苷酸整合的选定的DNA链可以用作探针以杂交到测试的细胞和组织中的互补序列上，然后通过荧光显微镜或成像系统进行观测［32］。FISH技术有3个主要的优点：① 能够高灵敏度和特异性识别目标DNA或RNA 序列［33］；② 直接应用于中期染色体和间期核［34］；③ 在单细胞水平的杂交信号的可视化［35］。并且多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列，既可以在载玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构［36］。但是FISH技术不能保证100%杂交，这种现象在应用较短的cDNA探针时表现明显［32］。

1.5 磁共振对比增强剂标记示踪法：此技术是在体外将待移植细胞用MR增强剂标记后移植，然后利用磁共振成像（magnetic resonance imagine，MRI）对细胞进行追踪。磁共振示踪剂种类多样，目前效果较理想同时也是研究热点的磁共振示踪剂是超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxides，SPIO）。纯应用SPIO标记细胞效率较低，经过转染剂修饰后能提高细胞的有效磁标记率。MRI可检测到很少量的磁标记细胞甚至是单个细胞，灵敏度高，同时磁标时间长［37］。然而，SPIO作为示踪剂时仍存在不足：① 由于干细胞增殖，SPIO标记的子细胞会失去一些SPIO标记，因此，当SPIO浓度低时不能保持初始高标记效率；② 随着细胞的死亡，残留在死亡组织内的SPIO微粒或被巨噬细胞吞噬SPIO微粒可能造成假阳性结果［38］；③ SPIO用量越高标记效率越高，但是高剂量的SPIO可能对细胞有害，导致细胞活力降低［39］。因此，SPIO适用于短期示踪细胞在体内或体外的增殖分化情况。

1.6 量子点（quantum dots， QDs）标记示踪法：QDs大多是由硒化镉制成的半导体荧光纳米晶，其独特的光学特性使其越来越多地被应用于活细胞标记［40］，近年来，QDs的发展已经有超过有机荧光剂发展趋势［41］。与有机荧光蛋白相比，QDs有多方面的优势，实验中常见的荧光标记物主要为有机小分子，由于这些小分子光稳定性差，无法满足干细胞治疗的长时间与高稳定性的监测要求［42］。相比而言，QDs具有较强的光稳定性、较长的荧光寿命，并且在观察标记的干细胞不需要注入其他的试剂或酶等［43］。在一定浓度范围内，QDs不会引起细胞形态和增殖改变，不影响细胞的正常生理代谢［44］。鉴于以上优点，QDs适用于长期示踪活细胞在体内的迁移、增殖及分化情况。

然而，大多数量子点含有镉离子，具有高水平的毒性，这使得量子点在浓度较大时对标记的细胞具有生理毒性，影响标记细胞的增殖［45］。有研究人员开发了无镉的QDs，通过实验证明，在同一浓度下，无镉QDs对细胞增殖影响比含镉QDs低，但粒子的亮度和摄取水平基本相似，示踪效果接近［46］。因此，如何在不降低量子点分辨率的前提下，降低不良反应的无镉或毒性较小的量子点的发展是很有前景的［47］。

2 示踪常用仪器

成像技术的发展与干细胞示踪关系密切，目前常用的成像仪器包括荧光显微镜、核磁共振仪、流式细胞仪和共聚焦显微镜等，不同示踪技术应选择合适的成像仪器。荧光显微镜是最常用的荧光检测方法，常用于定性观察细胞内部荧光物质的空间分布和强度分布［48］，操作简便，但是定量分析能力较差［49］。

磁共振成像具有空间、时间分辨率高，有效成像时间长，对比度高等优点，可以同时获得生理及解剖信息，可以观察细胞的动态迁徙过程［50］，在活体细胞示踪中应用前景好，但是目前常用的示踪剂对细胞生理影响大，且操作麻烦，费用较高［39］。

流式细胞仪检测干细胞时，细胞经过荧光染色，被激光照射后，会产生不同波长的激发光，根据激发光的强弱，可以判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果如抗原量等，可定性定量分析［51］。但是流式细胞技术只能测量一个细胞的总核酸或蛋白质量，不能测量具体部位的量。

共聚焦显微镜是目前较先进、成像效果好并且可以进行定性定量分析的仪器。其主要优点是能够通过荧光样品的厚度范围为50 μm或以上的连续生产薄（0.5～1.5 μm）的光学部分，有深入现场消除或减少的背景信息的焦平面（即导致图像退化）的控制能力，显著提高对比度和清晰度。非侵入性的共聚焦光学切片技术对各种标本的检测具有更高的清晰度，并可定性定量地进行免疫荧光测定［52］。

3 总结与展望

目前，干细胞具有广阔的临床应用前景，许多实验表明移植入宿主体内的干细胞能促进宿主体内器官损伤的修复，优秀的干细胞标记示踪技术有助于研究者进一步了解干细胞在动物模型内发挥功能的机制，最终使其转化为有效的临床治疗手段。成熟的干细胞标记示踪方法众多，每一种方法都有其优缺点，不同细胞情况或动物实验类型需选择合适的示踪方法，在需要时可联合应用两种或多种示踪方法，利用其各自的优点，达到良好的示踪效果。

理想的示踪方法应具有简单易行、特异性强、灵敏度高、受外界干扰因素小和假阳性率低等特点，此外，寻找最佳示踪效果与示踪剂细胞毒性之间的平衡是发展新型示踪剂的关键问题。随着干细胞示踪研究的不断深入，其势必会对干细胞治疗产生较为深远的影响。