降烟碱融合子及其亲株大田降解烟叶中烟碱的研究

邓高毅，彭 宇，王远亮

（1.湖南农业大学食品科技学院/食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；

2.湖南中烟技术中心，湖南 长沙 410014）

降烟碱融合子及其亲株大田降解烟叶中烟碱的研究

邓高毅1，彭 宇2，王远亮1

（1.湖南农业大学食品科技学院/食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；

2.湖南中烟技术中心，湖南 长沙 410014）

为降低上部烟叶中过高的烟碱含量，使用解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌和融合子A2等3种不同菌液对烟株进行叶面喷洒和根灌处理，研究不同菌液、处理次数、处理方式对烟碱降解率、菌株驻留时间及上部烟叶品质的影响。结果表明，根灌的处理方式不能达到降解烟叶中烟碱的目的，而使用菌液进行3次叶面喷洒后其降解烟碱的效果较好，解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌和融合子A2的烟碱降解率分别为17.7%、18.5%、25%，融合子A2的降解烟碱的效果最佳；绿色荧光蛋白（GFP）示踪试验中，使用菌液喷洒叶面后，菌株随着时间的推移会逐渐消亡；而处理后烟叶品质各化学成分含量在适当范围内，上部烟叶品质有得到改善趋势。在菌液喷洒烟叶条件下，烟叶中的烟碱含量显著降低，上部烟叶品质得到改善。

烟碱；烟叶；解淀粉芽孢杆菌T11；边缘假单胞菌；融合子；GFP

烟碱含量是决定烟叶品质优劣的主要指标之一。优质烤烟的烟碱含量一般为1.5%～3.5%，然而我国部分地区烟叶的烟碱含量偏高，特别是上部烟叶，有的烟碱平均含量在4%以上［1-2］，不仅严重影响了烟叶品质，对吸烟者的神经也会产生更强的刺激作用，进而危害身心健康。传统烟草种植工艺采用改善种植条件、优化打顶技术等手段，以降低烟叶中过高的烟碱含量［3-4］。此外，还可在烟叶加工过程中通过滤嘴过滤、烟叶切薄片等物理手段来降低烟碱含量，但效果并不显著［5-7］。

国内外学者已从烟草生长环境中分离出多种具有降解烟碱能力的微生物，其中以细菌数量最多、真菌数量次之［8-10］。刘飞等［11］从烟草根围的土壤中分离得到302株具有降解烟碱能力的细菌，以芽孢杆菌属降解烟碱的能力最强。苏玉龙等［12］在使用巨大芽孢杆菌降解烟碱后发现，该菌能在发酵20 d后将发酵液中的烟碱完全降解。陈德鑫等［13］使用短小芽孢杆菌MK21处理烟丝发现，发酵5 d后烟丝烟碱降解率为26.3%，烟丝的香气成分也得到了改善。利用微生物降解烟碱，特别是使用微生物直接处理大田时期的烟叶，既可以降低烟叶中过高的烟碱含量，还可以改善卷烟香气的成分比例，从而提高烟叶资源的利用率，具有较强的研究开发价值。因此，本试验使用融合子A2及其亲株解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌来处理大田时期的上部烟叶，以期降低上部烟叶中过高的烟碱含量，以进一步改善烟叶品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

融合子A2、解淀粉芽孢杆菌T11及边缘假单胞菌均导入了绿色荧光蛋白质粒（GFP质粒）并成功表达绿色荧光蛋白（GFP）。

固体烟碱培养基：0.5 mL微量溶液（0.4 g MnSO4·7H2O，0.2 g CaC12·2H2O，0.2 g FeSO4·7H2O，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL），1 g烟碱，13.3 g K2HPO4·3H20，4 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，蒸馏水定容至1000 mL，添加2%琼脂粉即为固体烟碱培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株田间降解烟碱试验 （1）菌株活化：将解淀粉芽孢杆菌、边缘假单胞菌及融合子A2分别接种到100 mL液体营养培养基中，置于37℃、120 r/min恒温摇床中培养12 h。（2）菌体扩培：将活化好的菌分别接入装有2.5 L液体营养培养基的容器中。（3）菌液前处理：将菌液离心并收集菌体，使用时用生理盐水制成悬浮液。（4）烟株分组：选择364株无病害且烟株长势相对一致的烟草为试验烟株，平均分为7组进行试验。第1～4组分别使用解淀粉芽孢杆菌、边缘假单胞菌及融合子A2悬浮液对烟株进行叶面喷洒处理（50 mL/株），其中第1组处理1次，第2组间隔5 d处理2次，第3组间隔5 d处理3次，第4组连续4 d处理4次。第5组使用根灌的方式处理烟株1次（100 mL/株）。第6、7组为空白对照，其中第6组用等量生理盐水喷洒烟叶（CK1），第7组使用等量生理盐水根灌烟株（CK2）。试验周期为25 d。（5）烟叶取样：在处理烟株当天早上取样，称量烟叶鲜重后置于烘箱中杀青、烘干，将烘干后的烟叶充分研磨，备用。（6）烟碱含量测定：准确称取0.1 g已烘干至恒重的烟叶粉末，置于150 mL三角瓶中，加入0.2 g活性炭粉末和25 mL 0.5 mol/L盐酸，加热使三角瓶中的液体沸腾后保持5 min，将沸腾后的液体转移至250 mL容量瓶中定容，过滤，弃掉最初10 mL滤液，收集约30 mL滤液进行比色，分别于波长236、259、282 nm下测定滤液的吸光度值［14-15］。

游离烟碱（mg/g）=1.059×〔A259-0.5（A236+A282）〕×V×1 000／样品重×（1-含水率）×34.3×1000。式中，1.059为校正系数，V为定容体积，34.3为烟碱的比吸收系数。

1.2.2 菌株在烟叶上驻留时间的示踪试验 分别采摘第1组中处理5、10、15、20、25 d的烟叶，对其进行微生物驻留时间研究。分别剪取使用解淀粉芽孢杆菌、边缘假单胞菌及融合子A2菌液处理后的部分烟叶，将剪取后的烟叶置于含有50 mg/L氨苄青霉素的固体烟碱培养基中。全部培养基于30℃恒温培养箱中静置3～5 d后，将长出的菌落挑取至含50 mg/L氨苄青霉素的液体营养培养基中培养24 h后离心，生理盐水洗涤菌体3次后重新悬浮于生理盐水中，以生理盐水为空白对照，使用多功能酶标仪测定悬浮菌液的相对绿色荧光强度。若其相对荧光强度与对照组的比值大于3则可以认为该菌株表达了GFP［16］，说明该菌株在对应的试验时间内还存活于烟叶中。

另取第1组中处理5、10、15、20、25 d的部分烟叶进行荧光镜检。烟叶页面切片后使用荧光倒置显微镜观察各批次烟叶切片中是否有绿色荧光物质出现，观测到绿色荧光点则说明该批次烟叶上有试验菌株存在。

1.2.3 影响烟叶品质的主要化学物质测定 在处理25 d采摘第3组烟株的烟叶，称量烟叶鲜重后，使用烘箱对烟叶进行杀青，烘干后封装送检，检测烟叶中总糖、还原糖、总氮、钾、氯以及烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟碱的含量，分析菌株处理烟叶后烟叶品质的变化情况。

采用Origin8.0软件对数据进行统计，并作图分析。

2 结果与分析

2.1 菌液对大田中烟叶烟碱含量的影响

从表1可以看出，在试验周期内未喷洒任何菌液的烟叶其烟碱含量基本维持在4.1%。喷洒1次融合子A2、边缘假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌T11菌液的处理，处理25 d其烟叶烟碱含量分别为3.68%、3.82%、3.88%，比未用菌液处理前分别降低了10.89%、6.83%、7.18%。其中边缘假单胞菌菌液处理20 d与25 d的烟碱含量分别为3.83%和3.82%，烟碱含量下降趋势极其不显著。处理1次的组别在处理25 d前，融合子A2及解淀粉芽孢杆菌T11处理的烟碱含量不断下降，说明它们在试验周期内一直存活于烟叶中。而边缘假单胞菌处理20 d后并未起到降解烟碱的效果，说明烟叶上的边缘假单胞菌从处理20 d开始逐渐消亡。

表1 大田烟叶中烟碱含量（%）变化情况

使用3种不同菌液间隔5 d处理2次烟叶后，边缘假单胞菌和解淀粉芽孢杆菌T11菌液处理的烟叶其烟碱含量由原来的4.10%、4.17%分别降至3.56%、3.69%，烟碱降解率分别为13.17%、11.51%。融合子A2的烟碱降解率最高、达到18.31%，比亲株边缘假单胞菌和解淀粉芽孢杆菌T11的烟碱降解率分别高出5.14%和6.8%，3种菌液叶面喷洒处理2次的烟碱降解率差异极显著。

烤烟上部烟叶的烟碱含量要求控制在3.5%以下，而过高的烟碱含量会降低烟叶品质。大田时期的烟叶经3种不同菌液间隔5 d处理3次后，边缘假单胞菌及解淀粉芽孢杆菌T11处理组的烟碱降解率分别为18.57%、17.7%，而融合子A2处理组的烟碱含量由4.16%降到3.12%，其烟碱降解率比亲株高出5%以上。间隔5 d共处理3次烟叶后，不管是融合子还是亲株处理组，处理25 d烟叶的烟碱含量均低于3.5%，符合优质上部烟叶烟碱含量的要求。

使用菌液连续处理烟叶4次的组别中，未经菌液处理时烟叶的烟碱含量为4.12%、4.15%、4.11%，处理25 d的烟碱含量为3.06%、3.32%、3.30%。3种不同菌液在25 d试验周期内的烟碱降解率分别为25.73%、20%、19.7%。融合子A2处理25.73%烟碱降解率与间隔5 d处理3次时的25%降解率相比，差异不显著，说明融合子A2处理烟叶3次后已取得较好的降解烟碱效果。

使用3种菌液分别根灌处理烟株1次后，其中用融合子A2处理后各阶段的烟叶烟碱含量分别为4.12%、4.10%、4.11%、4.10%、4.12%、4.12%，差异不显著，即烟叶的烟碱含量在试验周期内基本不变。使用边缘假单胞菌及解淀粉芽孢杆菌T11菌液根灌处理烟株后，其烟碱含量变化与融合子A2的趋势一致，均没有降低烟碱含量，说明根灌处理方式并不能有效降解烟碱。

2.2 菌株在烟叶上驻留时间分析

从表2可以看出，融合子A2及解淀粉芽孢杆菌T11在烟叶上的驻留时间至少为20 d，驻留25 d没有检测到菌株存在，说明喷洒融合子A2及解淀粉芽孢杆菌T11菌液后，其降解烟碱的有效时间长达20 d以上。而边缘假单胞菌在烟叶上的驻留时间至少为15 d，因此边缘假单胞菌在烟叶上降解烟碱的时间至少为15 d以上。

表2 多功能酶标仪检测菌株的相对绿色荧光强度

从图1～图3（封二）可以看出，驻留5、10、15、20 d均检测到融合子A2和解淀粉芽孢杆菌T11的存在，其荧光强度及亮点数目随着时间的推移而减弱、减少。而边缘假单胞菌在驻留20 d的烟叶样品中并未检测到绿色荧光点，即在驻留20 d的烟叶中没有发现边缘假单胞菌。荧光显微镜的检测结果与酶标仪的检测结果一致，相互印证了融合子A2、解淀粉芽孢杆菌T11至少可以在烟叶上驻留20 d，而边缘假单胞菌则至少可以在烟叶上驻留15 d，15 d后边缘假单胞菌开始消亡。

2.3 不同菌液处理对烟叶品质的影响

烟叶化学成分的协调性是生产优质卷烟的化学物质基础，不能偏高也不能偏低，而烟叶中的总糖、还原糖、总氮、烟碱、氯、钾等成分含量是决定烟叶品质优劣的重要指标。由表3可知，各处理间烟叶的总糖、还原糖、总氮、钾及氯含量均无显著差异，无论是叶面喷洒边缘假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌T11还是融合子A2菌液的处理，其总糖、还原糖等5种化学物质的含量与没有喷洒菌液（喷洒蒸馏水）的空白对照相比没有较明显差异，而喷洒菌液的烟叶烟碱含量与空白对照有极显著差异。从表3可以看出，与空白对照相比，喷洒菌液不会对烟叶的总糖、还原糖、总氮、氯及钾含量产生较大影响，但降低了烟叶中过高的烟碱含量。

烤烟烟叶的烟气醇和度主要由总糖和还原糖含量决定，如果总糖含量过低，在吸食时烟丝会给人一种比较刺激而呛鼻的感觉。在吸食烟丝时，糖会分解发生酸性反应，与烟丝中生物碱发生中和反应，因此可以将糖碱比作为评价烟丝吸食时的劲头与吃味的指标。国内优质烤烟的糖碱比一般控制在8～10，当比值低于5时，吸食时烟丝会产生一种刺激而涩苦的味。由表3可知，菌液处理后的烟叶糖碱比在8.5左右，而对照组的糖碱比为6.41，因此3种菌液均提高了烟叶中的糖碱比，有效改善了烟叶品质。

表3 菌液处理3次后上部烟叶化学成分含量

烟叶中过高的含氮化合物不仅会对烟丝品质造成较大影响，对人体健康也会产生不良影响。氮碱比一定程度上可作为反映烟叶在成熟过程中氮转化成烟碱氮的一个指标，一般烤烟的氮碱比要求控制在0.8～1.1，而本试验中烟叶氮碱比在0.5左右，比优质烟叶的氮碱比略低。但菌液处理的烟叶氮碱比比对照组的氮碱比大，因此3种菌液均能有效改善烟叶的氮碱比。

适宜的氯含量不仅能促进烟草的营养生长，还可赋予烟叶弹性，提高其切丝率。优质烟叶中的氯含量在0.4%～0.7%，实验组的烟叶中氯含量接近0.4%，氯含量有偏低的趋势。一定的钾含量对烟叶有助燃性，烤烟中常用氯钾比来判定烟叶可燃性，优质烤烟的氯钾比应控制在4～10，提高烟叶的氯钾比有利于提高可燃性。各处理烟叶氯钾比在4.5左右，因此喷洒菌液不会对烟叶的氯钾比产生显著影响。

烟草总生物碱是影响烟叶品质的重要化学成分，包括烟碱、降烟碱、假木贼碱及新烟碱等生物碱，而烟碱是影响烟叶品质最重要的化学物质。国内优质烤烟的烟碱要求一般控制在1.5%～3.5%，喷洒菌液后的烟叶烟碱含量达到这一要求，基本控制在3%左右。

降烟碱、假木贼碱及新烟草碱等生物碱占烟草生物碱的比例不到5%，但其对烟叶品质有着不可忽视的作用。降烟碱是烟碱去甲基化形成的一种烟草生物碱，其直接影响卷烟的香吃味，降烟碱含量的升高会对烟叶香味品质产生负面影响，即使增加量非常小，也会极大影响烟叶的香气品质。由表4可知，空白对照比喷洒了菌液的烟草降烟碱含量要高，因此使用菌液处理烟叶有助于增加香气。假木贼碱对吸食烟丝的劲头及刺激性有间接或直接影响，对照与菌液喷洒处理烟叶的假木贼碱含量无显著差异，表明菌液喷洒并没有对烟叶新木贼碱含量产生显著影响。新烟草碱对烟丝评吸指标（如香气质、香气量、余味等）的贡献较大，但菌液处理组的新烟草碱含量与对照相比无显著差异。

表4 菌液处理3次后上部烟叶生物碱含量（%）

3 结论与讨论

本试验中3种不同菌液均能降低烟叶中过高的烟碱含量，烟碱降解率随着菌液喷洒次数的增加而增大。其中间隔处理3次后，解淀粉芽孢杆菌T11处理的烟碱含量由4.2%下降到3.45%、降解率为17.7%，而边缘假单胞菌及融合子A2分别为18.57%、25%，可见，融合子A2降解烟碱的能力比亲株强。国内优质烤烟的烟碱含量一般要求控制在1.5%～3.5%之间，过高的烟碱含量不仅降低烟叶品质，而且对人体健康会产生更大危害。本研究中，处理3～4次后的烟碱含量均降到3.5%以下，有效改善了烟叶品质。Uchida等［17］从以烟碱为唯一碳源的固体培养基分离得到争论产碱菌，但该菌菌液喷洒到烟叶后，在5 d内烟叶烟碱含量并没有出现下降趋势，与之相比，解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌及融合子A2能在大田时期有效降低烟叶中烟碱含量。国内外学者分离得到多种具有降解烟碱能力的微生物，但很少有将这些微生物应用于大田降解烟碱的报道，Tashiro等［18］从被烟碱污染的土壤和废水中分离得到54种细菌，这些降解烟碱的细菌能在14 d内将浓度为1 mg/mL烟碱完全降解，但该菌并未被进一步应用于降解大田时期烟叶的烟碱。菌株在烟叶上驻留时间的试验表明，喷洒菌液后，菌株并不会一直存活于烟叶表面，而是随着时间的推移慢慢消亡。解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌及融合子A2在处理25 d后均未被检出，因此烟叶中的烟碱含量会在解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌及融合子A2消亡后而趋于稳定。

虽然解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌及融合子A2能有效降低烟碱含量，但是还应考虑

其对烟叶品质的影响。与空白对照相比，解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌及融合子A2处理组的总糖、还原糖、总氮、氯、钾等化学成分含量没有出现显著变化，但其中的糖碱比比对照高。可见，菌液不仅有效降低了烟碱含量，还改善了烟叶其他品质。国内许多地区的烤烟烟碱含量普遍偏高，如湖南湘西部分地区的烤烟烟碱含量竟达6%［19］，过高的烟碱含量直接影响了烟叶的再加工及利用，且过高烟碱量对吸烟人士脑神经的刺激性更强，产生的副作用更大，此外，废弃烟叶的烟碱会造成烟碱污染，破坏生态环境。因此，使用菌液降解烟碱既可以提高烟叶的加工价值，还可降低对吸烟人士、生态环境的危害，这是解淀粉芽孢杆菌T11、边缘假单胞菌及融合子A2应用价值的优势所在。

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（责任编辑 白雪娜）

Study on degrading nicotine in tobacco leaves by nicotine-degrading fusant and its parent strains

DENG Gao-yi1，PENG Yu2，WANG Yuan-liang1
（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology/ College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Technology Center of China Tobacco Hunan Industrial Co. Ltd.，Changsha 410014，China）

In order to reduce the nicotine content in upper leaves of tobacco，two different treatment ways of foliar spraying and root irrigation were designed with Bacillus amyloliquefaciens T11，Pseudomonas marginalis and fusant A2. The effects of different bacterial fluid，treatment times and treatment methods on nicotine-degrading efficiency，strain residence time and the quality of tobacco upper leaves were studied. The results showed that root irrigation could not achieve the purpose of degrading nicotine in the tobacco upper leaves. And the degradation of nicotine was better than root irrigation after 3 times of foliar spraying. The degradation rates of nicotine by B. amyloliquefaciens T11，P. marginalis and fusant A2 were 17.7%，18.5% and 25%，respectively. The effect of fusant A2 on nicotine degradation was the best. In the GFP tracer experiment，the strains would gradually extinct after spraying bacteria liquid. After treatment，the quality of tobacco upper leaves was in the appropriate range，and there was an improved tendency to the quality of tobacco upper leaves. Therefore，under foliar spraying conditions，the nicotine content in tobacco upper leaves significantly decreased，and the quality of tobacco upper leaves was improved.

nicotine；tobacco leaves；Bacillus amyloliquefaciens T11；Pseudomonas marginalis；fusant；GFP

S182

A

1004-874X（2017）01-0023-07

2016-11-15

湖南中烟工业有限责任公司项目“基于生物技术降低烟碱的关键技术研究”（KY2012YC0001）

邓高毅（1989-），男，在读硕士生，E-mail：610715556@qq.com

王远亮（1976-），男，博士，教授，E-mail：408083310@qq.com

邓高毅，彭宇，王远亮. 降烟碱融合子及其亲株大田降解烟叶中烟碱的研究［J］.广东农业科学，2017，44（1）：23-29.