未治和经治慢性乙型肝炎患者的病毒基因型分析及其核苷酸类似物耐药突变的模式特征

谭亚峰 欧阳耀灵

未治和经治慢性乙型肝炎患者的病毒基因型分析及其核苷酸类似物耐药突变的模式特征

谭亚峰1欧阳耀灵2★

目的检测分析未治和经治慢性乙型肝炎患者病毒基因型及其核酸类似物耐药突变位点的模式特征，为慢性乙型肝炎患者的抗病毒治疗方案提供依据。方法随机选取74例未治和66例经治的慢性乙型肝炎患者，PCR反向斑点杂交法检测其血清乙型肝炎病毒的基因型及核苷酸类似物耐药基因突变位点。结果未治患者与经治患者的血清乙型肝炎病毒基因型均以B型为主，两组差异无统计学意义（P＞0.05），未治患者HBV C型的比例低于经治患者（P＜0.05），B+C和B+D型的比例则高于经治患者（P＜0.05）。未治患者同样存在耐药基因突变：尽管其B型和C型HBV的耐药突变比例均低于经治患者（P＜0.05），但其B+D型HBV的耐药突变比例高于经治患者（P＜0.05），且以236T单基因突变为主；经治组患者HBV耐药突变单位点180M、204V和204I例数均高于未治组，而且经治组患者比未治组患者有更多的多位点耐药突变（P＜0.05）。结论HBV B基因型是本研究主要的基因型。未治患者亦存在耐药基因耐药突变，以B+D型HBV的耐药基因突变和236T单基因突变为特征；与未治患者相比，经治患者有更多的单基因位点和多基因位点的突变。未治和经治慢性乙型肝炎患者，均应在治疗过程中定期监测NAs耐药突变发生，以便及时选择最佳治疗方案。

HBV未治患者；HBV经治患者；HBV基因型；NAs耐药突变

HBV基因型与临床表现、治疗效果、预后和药物抵抗均有一定关系，并存在地域分布特点［1⁃2］。随着HBV抗病毒药物特别是核苷（酸）类似物（nucleotide analogues，NAs）在临床中的应用普及，HBV发生NAs相关耐药基因位点突变而导致耐药更为常见［3］。使用核苷（酸）类似物拉米夫定（lamivudine，LAM）、阿德福韦酯（adefovir，ADV）、替比夫定（telbivudine，LdT）、恩替卡韦（entecavir，ETV）治疗的患者通过短期治疗难以实现持久应答，随着治疗时间延长，NAs耐药发生率逐渐增加是乙肝治疗中面临的严峻问题［4］。Januszkiewicz⁃L D等［5］发现从未治疗过的HBV患者也会出现耐药相关突变位点，但报道不多。研究HBV未治患者基因型和NAs耐药基因位点突变情况，为HBV治疗策略的制定提供依据，本文对HBV未治患者与经治患者血清样本进行了HBV基因型和耐药基因位点检测，并对检测结果进行了分析比较，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本收集

随机收集2014年8月至2016年4月湖北省荆州市中心医院门诊和住院慢性乙型肝炎感染患者（HBV DNA＞1.00E3 IU/mL），其中未治疗患者74例，男49例，女25例，年龄（36.432±12.941）岁和经NAs治疗的患者66例，男53例，女13例，年龄（38.667±14.812）岁。两组患者年龄与性别的差异均无统计学意义（P＞0.05）。门诊患者通过口述和电话随访，住院患者通过查阅病历和病床前随访，从未经NAs治疗的患者纳入未治组，接受过NAs治疗的患者纳入经治组。抽取患者空腹静脉血3 mL，4 h内分离血清，4℃保存，12 h内进行HBV DNA扩增，产物于-20℃保存，在合适的时间解冻做核酸杂交试验检测HBV基因型和耐药突变位点。

1.2 仪器与试剂

美国Backman仪器有限公司生产的AllcegraTM21R高速冷冻离心机；英国Techne公司生产的GENIUS扩增仪；亚能生物技术（深圳）有限公司生产的YN⁃H16恒温杂交杂仪；海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产的TS⁃8摇床，PCR反向斑点杂交法检测HBV基因分型和耐药突变基因试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司提供。

1.3 方法

HBV DNA的提取、PCR扩增及核酸杂交检测均按照试剂盒说明书操作。在杂交结果质控正常的基础上根据显色出现的阵列位点直接判读HBV的基因型和耐药突变类型。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行数据处理，两组数据间的HBV基因型和耐药位点比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

74例HBV未治患者和66例HBV经治患者中成功检测到HBV基因型及部分患者NAs相关耐药基因位点。

2.1 HBV未治患者和经治患者HBV基因型检测结果

HBV未治患者和经治患者HBV基因型检测结果见表1，两组间除HBV B型无统计学差异外，未治患者HBV C型比例低于经治患者，而B+C和B+D型则高于经治患者。

2.2 HBV未治患者和经治患者HBV不同型别耐药突变基因检测

表1 HBV未治患者和经治患者HBV基因型检测结果[n(%)]Table 1 The comparison of HBV genotypes among the untreated and treated patients[n(%)]

表2 未治和经治患者不同HBV基因型耐药突变基因比较[n(%)]Table 2 The comparison of main resistant mutants sites in diverse HBV genotypes among the untreated and treated patients[n(%)]

HBV未治患者和经治患者HBV不同型别耐药突变基因检测比较见表2。两组间耐药突变除HBV B+C型差异无统计学意义外，未治患者HBV B型和C型比例均低于经治患者，而B+D型则高于经治患者。

2.3 HBV未治患者和经治患者HBV耐药基因位点检测结果

74例HBV未治患者和66例经治患者HBV耐药突变检测结果见表3，经治患者HBV耐药突变位点180M、204V和204I比率均高于未治患者，但经治患者HBV耐药突变位点236T比率低于未治患者，两组患者间其它位点突变差异无统计学意义。HBV耐药基因单基因突变见表4，多基因突变见表5。经治患者组与未治患者组单位点耐药突变差异无统计学意义（χ2=0.031 2，P＞0.05）；经治患者组16例（24.242%）与未治患者组4例（5.405%）多位点耐药差异有统计学意义（χ2=10.109，P＜0.05）。

表3 HBV未治患者和经治患者HBV耐药基因位点检测结果[n(%)]Table 3 The comparison of resistant mutant among the untreated and treated patients[n(%)]

表4 HBV未治患者和经治患者HBV耐药单基因突变Table 4 The single mutant among the untreated and treated patients

3 讨论

乙型肝炎病毒的基因型分布不仅有明显的地区差异，而且与治疗的预后密切相关。BaqlaniSA等［6］对HBV感染患者179例血清样本研究发现，HBV基因型 D（130/170，76.47%）和A（32/170，18.82%）是阿曼主要的基因型。我国主要为B、C型，少见D型，中国南方和北方也有差异［7］。我们早期对经治者研究也发现B型和C型是湖北荆州地区慢性乙型肝炎患者HBV的优势基因型［8］。本次研究的HBV基因型分布流行病学特征与国外研究结果有差异［6］，而与国内的研究结果基本一致［7］。同时我们在未治患者组发现7例B+D型，而经治组中则未发现B+D型。本研究发现，B+C型中以C型为主；B+D型中以B型为主，提示NAs经治患者和未治患者HBV基因型分布有差异。罗杰等［9］研究发现，在HBV治疗过程中病毒基因型有可能发生改变，这种基因型改变是否与病毒的耐药突变相关联？详细机理何在？值得进一步研究。

表5 HBV未治患者和经治患者HBV耐药多基因位点突变Table 5 The diverse mutants among the untreated and treated patients

本次研究中，无论是未治抑或经治慢性乙型肝炎患者，其病毒均存在耐药突变，而且HBV的基因型与病毒的耐药突变均呈现一定的关系。尽管B+C型HBV的耐药突变在未治和经治两组间的差异无统计学意义，但经治组HBV B和C型耐药突变高于未治组，尤其在多位点耐药突变方面，经治患者多于未治患者，提示HBV B和C型的经治患者在治疗过程中更易诱发耐药。未治患者B+D型HBV较易出现耐药突变，且以236T单位点突变为主，这是区别于经治患者病毒耐药突变的特征之一。

文献研究［5］认为HBV自然突变导致抗病毒抵抗还不十分清楚，他们对HBV患者P区基因研究发现2.66%（7/263）从未接受NAs治疗过的HBV患者血清中检出耐药基因，认为检出耐药突变的未治患者有可能被HBV耐药株感染。Ciftci S等［10］在从未接受NAs治疗过的慢性HBV患者血清中检出37.5%（6/16）的患者存在耐药位点突变。Hamidi等［11］从伊朗一年以上未接受NAs治疗的HBV患者血清中检出51.1%（23/45）患者存在耐药突变，而大部分与ADV相关。rt204V、rt204I是HBV患者LAM和LdT耐药的独立判断因子［12］，rt236T是HBV患者ADV耐药的独立判断因子［13⁃14］。我们的检测结果显示未治患者HBV检测出耐药突变且以ADV相关位点rt236T突变为主，与文献［11］研究结果相符。HBV经治患者中检测出主要为LAM相关位点rt204I突变为主，可能与LAM最早普遍应用于临床有关。我们对单位点耐药及多位点耐药统计分析显示经治患者组与未治患者组单位点耐药无统计学差异；经治患者组与未治患者组多位点耐药有统计学差异。提示NAs治疗后患者多位点耐药发生率高于未治患者，与文献［10］的报道相符。根据2009年发布的《乙型肝炎病毒耐药专家共识》［12］，常见拉米夫定（LAM）耐药模式为：rt180M+rt204I、rt180M+rt204V、rt204I rt204V、rt207I、rt181V；阿德福韦酯（ADV）耐药模式为：rt181V、rt236T，结合本研究的实验结果，推测未治患者可能对单ADV及LAM+ADV产生耐药；经治患者可能对单LAM、单ADV及LMA+ ADV产生耐药，但仍需做进一步的研究。经治患者多位点耐药发生率高于未治患者。由于未治患者也有耐药突变存在，因此NAs治疗前检测HBV未治患者的基因型和耐药突变对患者成功治疗非常重要。在患者治疗过程中应定期监测NAs耐药突变，有利于调整最佳治疗方案。

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Detection of hepatitis B virus genotyping in untreated or treated patients of chronic hepatitis B and its mutation patterns of the nucleotide analogues⁃resistant mutants

TAN Yafeng1,OUYANG Yaoling2★
(1.The second clinical medical college,Yangtze university,Jingzhou,Hubei,China,434020;2.Department of Laboratory of Jingzhou Central Hospital,Jingzhou,Hubei,China,434020)

ObjectiveTo investigate and identify prevalent genotypes of hepatitis B virus(HBV) among untreated or treated patients with chronic hepatitis B(CHB)and the mutation pattern of the nucleotide analogues⁃resistant mutants.MethodsA total of 74 cases with CHB who did not receive the treatment of lamivudine and any other antivirus drugs and 66 cases with CHB who receive the treatment of lamivudine and any other antivirus drugs were randomly chosen.After sample collection and HBV DNA extraction,PCR reverse spot hybridization was used to detect HBV genotypes and the nucleotide analogues(NAs)⁃resistant mutants.ResultsThe main Genotypes of HBV is the B type in both untreated and treated patients.The rate of HBV C in the untreated patients was less than that of the treated patients(P＜0.05),while B+C and B+D were higher in the untreated patients compared with the treated patients(P＜0.05).The NAs⁃resistant mutants were found in both untreated and treated patients of CHB.Despite of the less rate of the NAs⁃resistant mutants in the virus genotypes B+C and higher rate of that in the virus genotypes B+D among untreated patientscompared with treated patients(P＜0.05),the single locus of NAs⁃resistant mutants were revealed 236T as the main mutation pattern in the untreated patients(P＜0.05).While the 180M,204V and 204I as the main single locus mutation pattern in the treated patients(P＜0.05)and,more multiple gene loci mutation were detected among the treated patients compared with untreated patients.ConclusionHBV B is the main genotypes in this research.NAs⁃resistant mutants existed in the untreated patients.The mutant sites in the treated patients were more both in single gene locus and multiple gene loci than that in the untreated patients.Investigation of NAs⁃resistant mutants before treatment is crucial for the success of the treatment.In whole course of antiviral treatment,NAs⁃resistant mutants should be monitored for the optimal schedule.

Untreated patients infected HBV;Treated patients infected HBV;HBV genotype;NAs⁃resistant mutants

1.长江大学第二临床医学院，湖北，荆州434020 2.荆州市中心医院检验医学部，湖北，荆州434020

★通讯作者：欧阳耀灵，E⁃mail:ouyangyaoling67@126.com.