番茄红素对山羊精液冷冻保存效果的影响

王艳华，朱海鲸，韩 聪，胡 珊，胡建宏

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.拉萨市动物疫病预防控制中心，拉萨 850000；3.榆林学院，陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，陕西榆林 719000)

番茄红素对山羊精液冷冻保存效果的影响

王艳华1,2，朱海鲸3，韩 聪1，胡 珊1，胡建宏1

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.拉萨市动物疫病预防控制中心，拉萨 850000；3.榆林学院，陕西省陕北绒山羊工程技术研究中心，陕西榆林 719000)

为研究番茄红素对山羊精液冷冻保存效果的影响，在山羊精液冷冻稀释液中添加不同质量浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)的番茄红素，检测冷冻-解冻后精子的活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性，并用试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。结果表明，1.0 mg/mL组的冷冻保存效果最好，精子活率、顶体完整率、质膜完整率和线粒体活性分别达到52.04%、51.33%、53.57%和49.31%，显著高于对照组，且SOD、CAT、GSH-Px 的活性也显著高于对照组；0.5 mg/mL组与2.0 mg/mL组的精子活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性及CAT和GSH-Px活性差异不显著；4.0 mg/mL组的精子活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性及SOD和CAT活性与对照组差异不显著。因此，在山羊精液冷冻稀释液中加入1.0 mg/mL的番茄红素对山羊精液具有显著的保护作用，能进一步提高山羊冻精品质。

番茄红素；山羊；精液；冷冻保存；精液品质

精液冷冻保存技术解决了精液长期保存的问题，使采精和受精在时间和空间上产生分离，延长精子的体外存活时间，最大限度地提高优秀种公畜的利用率，缩短品种改良周期。但精液冷冻保存过程对精子造成的物理性损伤、化学性损伤和氧化应激损伤使山羊精液冷冻保存技术的推广受到很大限制，其中，氧化应激损伤最大，引起精子氧化应激的最主要因素是过量活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的产生。生物体内自身有一套抗氧化体系，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)能及时清除产生的ROS，因此，正常生理状态下ROS的产生和消除处于动态平衡。精子在冷冻-解冻过程中，由于内外环境的刺激，使产生的ROS超过精子内抗氧化酶的抵御能力，造成ROS累积，从而破坏ROS的动态平衡，含有高浓度不饱和脂肪酸(PUFA)的精子质膜就极易遭受脂质过氧化损伤[1]，甚至引起精子DNA链的断裂[2]，导致精子死亡，而死亡精子会产生更多的ROS，形成恶性循环，最终导致解冻后的精液品质下降，从而影响精子的受精能力。为降低在冷冻保存过程中ROS对精液品质的影响，通常会在冷冻稀释液中加入外源的抗氧化剂。研究表明，在精液冷冻稀释液中加入维生素E[3]、维生素C[4]、硫辛酸[5]、谷胱甘肽[6]等抗氧化物质可有效提高精子细胞中抗氧化酶的活性，提高冷冻-解冻后的精子活率。Mangiagalli等[7]发现补饲番茄红素能有效提高低温保存的兔精子活率，并能作为一种抗氧化剂替代维生素E和维生素C广泛应用于动物生产。

番茄红素是一种重要的类胡萝卜素，具有抗氧化、抗衰老、抑制癌细胞增殖等多种功能[8]，是目前在自然界植物中发现的最强抗氧化剂之一，它是类胡萝卜素中最有效的单线态氧淬灭剂[9]，清除氧自由基速率是维生素E的100倍[10]。目前，已有研究报道番茄红素能提高人[11]、兔[12]、牛[13-14]、鸡[15-16]等动物精液的冷冻保存效果。采用口服番茄红素的方法对特发性男性不育症患者进行治疗后，患者的精液浓度和精子活力得到提高[17]，在鸡、兔的日常饮水中添加番茄红素可提高鸡精液低温保存后的精子活率[15]，降低兔精子冻融后的DNA损伤[12]。Bucak等[14]认为，在公牛精液冷冻稀释液中添加番茄红素可以显著提高精子活率和线粒体活性。但在山羊精液冷冻稀释液中添加番茄红素的研究尚未见报道，为研究番茄红素对山羊精液冷冻保存效果的影响，本试验采集3～4岁陕北白绒山羊的精液，在冷冻稀释液中添加不同质量浓度的番茄红素，通过测定冷冻-解冻后精子的活率、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性及相关抗氧化酶活性，筛选出添加番茄红素的适宜质量浓度，以期为山羊精液冷冻保存技术的广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂及药品 果糖(北京百瑞金生物科技有限公司)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，天津市瑞金特化学品有限公司)、柠檬酸钠(天津市瑞金特化学品有限公司)、柠檬酸(西安灞桥区化学试剂厂)、二甲基亚砜(Amresco 0231)、罗丹明123(R-8004，Sigma)、碘化丙啶(P4170，Sigma)、番茄红素(Solarbio)、异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素(Genmed，美国)。

1.1.2 试验动物 精液采自榆林陕北白绒山羊试验基地5只健康、繁殖性能好的陕北白绒山羊种公羊(3～4岁)。

1.1.3 冷冻稀释液的配制 基础稀释液：Tris 300 mmol/L，柠檬酸95 mmol/L，果糖28 mmol/L，超纯水100 mL，混匀，4 ℃保存，备用。

冷冻稀释Ⅰ液：精液稀释前，在基础稀释液中添加青霉素2 000 IU/mL、链霉素0.4 g/mL和φ=15%的卵黄。将配好的精液冷冻稀释Ⅰ液平均分装在5个离心管中，每个管中分别添加番茄红素，质量浓度分别为0(对照组)、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

冷冻稀释Ⅱ液：在稀释Ⅰ液的基础上添加φ=5%的甘油。

1.1.4 其他溶液的配制 精子低渗液：0.49 g柠檬酸钠和0.9 g果糖溶于100 mL双蒸水中。

碘化丙啶(PI) 贮存液：0.000 2 g PI溶于 10 mL的PBS 中，0.45 μm滤膜过滤后，-20 ℃避光贮存。

罗丹明123(Rh123)贮存液：0.000 2 g Rh123溶于1 mL DMSO，0.45 μm 滤膜过滤后，避光贮存。

1.2 试验方法

1.2.1 精液的采集与处理 采用假阴道法采集种公羊精液，在1 h内运回实验室，自然降至室温，进行常规品质检查，精子活力达到0.8以上方可用于冷冻保存。

1.2.2 精液的第1次稀释与平衡 将检测合格的精液加入2倍体积的冷冻稀释Ⅰ液，经多层纱布包裹后，于4 ℃冰箱中降温平衡2 h。

1.2.3 精液的第2次稀释与平衡 将第1次稀释和平衡后的精液加入2倍体积等温的(4 ℃)冷冻稀释Ⅱ液进一步稀释，使精液与稀释液的最终体积比为1∶4，经多层纱布包裹后，4 ℃冰箱中平衡1.5 h。

1.2.4 精液的冷冻与解冻 在4 ℃环境下，将精液分装于0.25 mL的冷冻细管，然后将封装好的细管放入程序冷冻仪，以 1 ℃/min 的速率从 5 ℃降至-5 ℃，当温度恒定在-5 ℃时，取出细管并迅速置于液氮面上方2～3 cm处，熏蒸6～8 min，熏蒸结束后迅速将细管投入液氮罐冷冻保存。2周后小心取出冷冻细管，投入37 ℃水浴，30 s解冻。

1.3 冻后精子质量指标的测定

1.3.1 活率 吸取解冻孵育后的精液样品10 μL于载玻片上，盖上盖玻片，置于37 ℃恒温载物台上，400×光学显微镜下观察5个视野，每个视野至少统计200个精子，直线运动精子数占总精子数的百分比为精子活率。

1.3.2 顶体完整率 采用异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)染色方法检测解冻后精子的顶体完整率。吸取解冻孵育后的精液样品30 μL均匀涂抹于载玻片上，待自然干燥后，甲醇固定10 min，然后加入10 μL FITC-PNA 染液，37 ℃潮湿环境下避光孵育30 min，PBS冲洗2次，空气干燥，用无色指甲油封片，于荧光显微镜下观察，顶体被染为绿色的精子为顶体功能完整的精子，计算精子顶体完整率。

1.3.3 质膜完整率 采用低渗肿胀(HOST)试验进行检测。取20 μL解冻孵育后的精液样品中加入等温HOST低渗溶液200 μL，混匀，37 ℃孵育1 h后，取10 μL均匀涂抹于载玻片上，在400×倒置显微镜下观察5个视野，尾部弯曲的精子为质膜完整的精子，弯尾精子的百分比即为质膜完整率。

1.3.4 线粒体活性 在试管中分别加入1 μL PI贮存液和1 μL Rh123贮存液，避光培养 10 min。吸取解冻孵育后的精液样品50 μL加入避光培养的PI和Rh123混合液，培养30 min，取 10 μL 样品制片，然后在 400×倒置显微镜下观察。活精子和有活性线粒体的精子头部不发光，而尾巴线粒体部分有绿色荧光，以此计算完整线粒体精子的百分率。

1.3.5 冻后精子抗氧化酶活性的测定 精液中SOD、CAT和GSH-Px的酶活性采用南京建成生物科技公司生产的试剂盒检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，数据以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度的番茄红素对山羊精液冷冻效果的影响

如表1所示，基础液中添加1.0 mg/mL番茄红素的冷冻保存效果最好，冻融后山羊精子活率、顶体完整率、质膜完整率和线粒体活性均显著高于对照组(P<0.05)，其中，精子活率和线粒体活性与2.0 mg/mL组无显著差异(P>0.05)；添加0.5 mg/mL番茄红素时，精子活率和顶体完整率与对照组无显著差异(P>0.05)，质膜完整率和线粒体活性与对照组差异显著(P<0.05)；添加2.0 mg/mL番茄红素时，各项指标均与对照组差异显著(P<0.05)；添加4.0 mg/mL番茄红素时，各项指标与对照组均差异不显著(P>0.05)，精子活率和线粒体活性低于对照组。

表1 不同质量浓度番茄红素下山羊精液的冷冻保护效果Table 1 Effects of different mass concentration of lycopene on freezing of goat semen

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values in the same column marked with different lowercase letters means significant difference (P<0.05).

2.2 不同质量浓度的番茄红素对山羊精子冻后SOD、CAT 和 GSH-Px 活性的影响

由图1-A可知，冻融后精浆中SOD活性在番茄红素的添加量为0.5、1.0 mg/mL时与对照组差异显著(P<0.05)，而2组间无显著差异(P>0.05)，2.0 mg/mL组和4.0 mg/mL组与对照组差异不显著(P>0.05)；由图1-B可知，添加1.0 mg/mL番茄红素时CAT活性最高，与对照组差异显著(P<0.05)但与0.5 mg/mL组无显著差异(P>0.05)，2.0 mg/mL组和4.0 mg/mL组则与对照组无显著差异(P>0.05)；由图1-C可知，添加0.5、1.0 和2.0 mg/mL番茄红素均能提高GSH-Px活性，其中1.0 mg/mL组和2.0 mg/mL组显著高于对照组(P<0.05)，但2组间无显著差异(P>0.05)，4.0 mg/mL组显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 稀释液中添加番茄红素对山羊精液冻后精子活率及质膜和顶体完整率的影响

本研究中，在山羊精液冷冻稀释液中添加0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的番茄红素时，虽然对冻后精液品质都有改善作用，但只有添加1.0 mg/mL 时效果最显著，这与Uysal等[17]的研究结果类似。原因可能有以下两方面：一方面由于山羊精子膜含有高质量浓度的不饱和脂肪酸，冷冻过程中极易遭受ROS的攻击[1]，而番茄红素是一种脂溶性的抗氧化物，脂溶性物质对细胞膜上的磷脂有特殊亲和性，占有膜上特殊位置，预防或阻止细胞膜上氧化反应的发生，从而保护精子膜不被氧化损伤，提高冻融后精子的质量；另一方面，范远景等[18]研究指出，番茄红素能够上调内源性抗氧化酶的活性(SOD、CAT和GSH-Px)，而这些抗氧化酶能够减少或清除精液在冷冻-解冻过程中产生的过量ROS，从而减轻精子遭受脂质过氧化损伤的程度， SOD、CAT和GSH-Px活性的提高与本研究结果相似。但Bucak等[14]研究发现，在公牛精液冷冻稀释液中添加1.0 mg/mL的番茄红素对冻融后精子活率、顶体完整性并无明显影响，线粒体活性却显著提高，其原因一方面可能是山羊精子与公牛精子结构或生物学特性差异造成，因为不同物种的精子内自身抗氧化酶系统对ROS的抵御能力不同，精子所遭受的氧化应激程度不同[19]，因此，相同质量浓度的抗氧化剂对冻精的作用也会不同；另一方面可能是精子活率、顶体完整率以及线粒体活性的测定方法不同。

图中小写字母不同表示差异显著(P<0.05) Different lowercase letters marked on black bar means significant difference at P<0.05

本研究中，随着番茄红素添加质量浓度的增加，山羊精液的冷冻保存效果反而下降，这与Uysal等[17]的研究结果类似，说明番茄红素对精液品质的影响具有剂量依赖性，Rosato等[16]的研究也证明这一点。本研究中，当番茄红素添加质量浓度高于2.0 mg/mL时，虽能改善冻融后精子品质，但是效果不及1.0 mg/mL组，原因一方面可能是山羊精子膜含有的大量不饱和脂肪酸使其渗透性增强，脂溶性的番茄红素更易进入细胞内部，而高质量浓度的番茄红素对精子有毒性[17]；另一方面可能是高质量浓度的番茄红素在溶液中聚集或结晶，而结晶的番茄红素不易溶解，改变了精子细胞的渗透压，从而损伤细胞。同样，低质量浓度的番茄红素对山羊精液的冷冻也不能起到很好的保护作用。

3.2 稀释液中添加番茄红素对精浆中抗氧化酶活性的影响

番茄红素能够辅助精子自身的抗氧化系统，减少自由基对精子的氧化损伤，进而改善冻融后的精子功能[16]。Rosato等[16]研究指出，番茄红素能够降低火鸡冻精细胞的脂质过氧化损伤程度。然而，本研究中，随着番茄红素添加量的增加，精浆中抗氧化酶活性出现降低趋势，当添加4.0 mg/mL的番茄红素时，SOD和CAT活性与对照组无显著差异，GSH-Px活性显著低于对照组，说明高质量浓度的番茄红素抑制抗氧化酶活性，推测可能与番茄红素潜在的促氧化作用有关。某些特定条件下，类胡萝卜素(CAR)可与ROS(ROO-)反应生成具有更强氧化性的过氧化自由基(CAR-OO-)[20]，加重细胞氧化损伤，导致抗氧化酶活性降低。Yeh等[21]以偶氮二异庚腈(AMVN)作为 Hs68 细胞的自由基生成剂，发现一定水平的番茄红素可促进脂质过氧化反应的发生，这提示在应用番茄红素作为抗氧化物质时，应注意其潜在的促氧化作用，调整番茄红素的用量，筛选出最适宜的添加量。本研究结果表明，当番茄红素添加量高于2.0 mg/mL时，SOD、CAT和GSH-Px的活性均显著低于1.0 mg/mL组，可能在此质量浓度时番茄红素已经表现出促氧化作用，当番茄红素添加量低于0.5 mg/mL时，SOD、CAT和GSH-Px的活性也明显低于1.0 mg/mL组，因此，番茄红素的适宜添加量为 1.0 mg/mL。

4 结 论

番茄红素对陕北白绒山羊冷冻精子具有较好的冷冻保护作用，能明显提高山羊冻精解冻后的活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性及抗氧化酶活性，减缓冷冻对精子的损伤程度，其最适添加质量浓度为1.0 mg/mL。

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(责任编辑：顾玉兰 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Lycopene on Cryopreservation of Goat Semen

WANG Yanhua1,2,ZHU Haijing3,HAN Cong1,HU Shan1and HU Jianhong1

(1.College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.Animal Disease Prevention and Control Center of Lhasa City,Lhasa 850000,China; 3.Shaanxi Province Research Center for Engineering & Technology of Shanbei Cashmere Goat Yulin University,Yulin Shaanxi 719000,China)

The aim of this study is to determine the effects of different amounts of lycopene(0 mg/mL,0.5 mg/mL,1.0 mg/mL,2.0 mg/mL,4.0 mg/mL) added to cryopreservation extender on the post-thawed sperm parameters (motilities,acrosome integrity,plasma integrity and mitochondrial activity) and antioxidant activities (SOD,CAT and GSH-Px) of sperm of white cashmere goat from Shanbei .The results showed that addition of lycopene was 1.0 mg/mL,the motility (52.04%),acrosome integrity (51.33%),plasma membrane integrity (53.57%) and mitochondrial activity(49.31%) were increased significantly and also had significant differences in enzyme activity of SOD,GSH-Px and CAT compared with the control group.For 0.5 mg/mL group and 2.0 mg/mL group,the motility,acrosome integrity,plasma membrane integrity,mitochondrial activity and CAT,GSH-Px activity were no significant difference between them.For 4.0 mg/mL group,the motility,acrosome integrity,plasma membrane integrity,mitochondrial activity and SOD,CAT activity were significantly lower than that of control group.The results of this study showed that lycopene supplementation in semen extenders was of greater benefit to sperm of frozen-thawed goat sperm,the best mass concentration was 1.0 mg/mL.

Lycopene; Goat; Semen; Cryopreservation; Semen quality

WANG Yanhua,female,master student.Research area:animal biological technology.E-mail: 634148126@qq.com

HU Jianhong,male,professor,doctoral supervisor.Research area: livestock reproductive and physiological regulation.E-mail: hjh19732008@126.com

日期：2017-03-03

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.076.html

2016-03-19

2016-05-17

国家绒毛用羊产业技术体系(CARS-40-13)；陕西省科技统筹创新工程计划(2014KTDZ02-01，2015KTTSNY04-03)。

王艳华，女，硕士研究生，从事动物生物技术研究。E-mail: 634148126@qq.com

胡建宏，男，教授，博士生导师，主要从事家畜生殖生理调控研究。E-mail: hjh19732008@126.com

S814.8

A

1004-1389(2017)03-0336-06

Received 2016-03-19 Returned 2016-05-17

Foundation item Sheep for Cashmere and Wool Industry Technology System (No.CARS-40-13);Shaanxi Science and Technology Co-ordinate Innovation Project (No.2014KTDZ02-01,No.2015 KTTSNY04-03).