两种利用micro-CT测量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的方法比较

崔 迪，张杨珩，张 婷，魏挺力，闫福华*

(1.南京大学医学院附属口腔医院牙周科，2.牙体牙髓科，3.口腔种植科，江苏 南京 210008)

两种利用micro-CT测量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的方法比较

崔 迪1，张杨珩1，张 婷2，魏挺力3，闫福华1*

(1.南京大学医学院附属口腔医院牙周科，2.牙体牙髓科，3.口腔种植科，江苏 南京 210008)

目的 比较两种利用微计算机断层扫描(micro-CT)测量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的方法。方法 结扎小鼠右侧上颌第二磨牙建立牙周炎模型，分离其右侧上颌骨后进行micro-CT扫描。由3名医师分别采用重建法(R法)和改良的断层测量法(T法)进行牙槽骨测量，分析比较两种测量方法的一致性和稳定性。结果 不同测量者采用R法进行测量的标准差(SD)为35.67 μm，采用T法的SD为14.24 μm，差异有统计学意义(P<0.05)；同一测量者采用R法测量3次所得结果之间的SD为34.87 μm，采用T法的SD为7.82 μm，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 采用T法测量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的一致性和稳定性均优于R法。

牙槽骨吸收；牙周炎；体层摄影术，X线计算机

图1 测量方法 A.测量位点； B.以R法测量各位点的CEJ-ABC； C.CT示小鼠上颌骨的冠状位(红色)、轴位(绿色)、矢状位(蓝色)； D.小鼠牙体长轴与y轴(红线)平行； E.牙合面近远中长轴与x轴(蓝线)平行； F.牙合面与z轴(绿线)平行； G.于冠状位测量某一位点的CEJ-ABC(两平行黄线之间的垂直距离)

牙槽骨吸收是牙周炎的典型病理改变，也是判定患牙愈后的重要依据之一[1]。目前测量牙槽骨吸收的方法主要包括组织病理形态学计量法[2]、亚甲基蓝硬组织染色法[3-4]、X线投照法[5]和CT三维重建[6]测量法。其中，组织病理形态学计量法为金标准[7]，CT测量结果与病理结果高度一致，是目前评价骨组织结构较常用的方法[8]。近十年来，微计算机断层扫描(micro computed tomography， micro-CT)因其分辨率高、操作简便、无创，可提供三维信息等优势，在牙周炎相关研究中得到越来越广泛的应用[9]。目前应用micro-CT测量牙槽骨吸收的研究大多由于各种原因，对测量时颌骨位置的选择并未明确阐述，导致结果可能存在较大误差。本研究建立小鼠牙周炎模型并进行micro-CT分析，对常用的重建法(R法)与本研究改良的断层测量法(T法)进行比较，以期为micro-CT测量牙槽骨吸收的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1建立实验性牙周炎动物模型与分组 取12只9周龄健康C57BL/6雄性小鼠(北京大学动物实验中心提供)，体质量17～22 g，平均(20.1±1.3)g。参照Ma等[10]的方法，于全麻(戊巴比妥75 mg/kg体质量、硫酸阿托品1.875 mg/kg体质量)下，以5-0丝线结扎小鼠右侧上颌第二磨牙(M2)，将丝线置于龈沟内。而后将所有小鼠饲养于恒温[(23.0±1.0)°]恒湿[(60.0±5.0)%]且12 h昼夜循环照明的环境下，自由进食、饮水，隔天检查丝线，如丝线脱落则将该小鼠剔除实验。分别于结扎后当日(A组)、3天(B组)、7天(C组)、28天(D组)随机处死3只小鼠，分离右侧上颌骨，以4%多聚甲醛固定24 h。

1.2micro-CT图像采集 采用Bruker SkyScan 1172型micro-CT扫描仪对各组小鼠上颌骨标本进行扫描。扫描时将标本置于泡沫塑胶管内，保持牙长轴与扫描平面平行。扫描参数：360°旋转，管电压50 kV，管电流445 μA，X线暴露时间265 ms，扫描层厚18 μm。通过NReconstruction重建获得三维图像。

1.3 测量方法 由3名牙周专业医师盲法采用R法及T法对各组进行独立测量。每1名测量者分别采用两种方法各测量3次，每次测量间隔1天。

1.3.1 R法 采用Miyajima等[11]的方法，通过SkyScan CTvox v.3.1.1软件调整图像位置，保存BMP格式的二维图像，并导入image-pro-plus 6.0软件进行测量。以釉牙骨质界(cement-to-enamel junction， CEJ)至牙槽嵴顶(alveolar bone crest， ABC)的距离(CEJ-ABC)作为牙槽骨吸收的参考标准。对小鼠上颌3颗磨牙(M1、M2、M3)的18个位点(颊侧、腭侧各9个)进行测量[12]，分别为M1：近颊/腭尖(mesio-buccal/palatal cusp， MBC or MPC)、颊/腭沟(buccal/palatal groove，BG or PG)、远颊/腭尖(disto-buccal/palatal cusp， DBC or DPC)、远颊/腭沟(disto-buccal/palatal groove， DBG or DPG)和远中牙尖(distal cusp， DC)；M2：近颊/腭尖(mesio-buccal/palatal cusp， MBC or MPC)、颊/腭沟(buccal/palatal groove， BG or PG)和远颊/腭尖(disto-buccal/palatal cusp， DBC or DPC)；M3：颊/腭尖(buccal/palatal cusp， BC or PC)，见图1。

图2 不同测量方法的准确性 (*：与采用R法产生的SD相比，P<0.05) 图3 结扎时间对准确性的影响 (*：与采用R法产生的SD相比，P<0.05) 图4 测量位点对准确性的影响 (*：与采用R法产生的SD相比，P<0.05) A.颊侧； B.腭侧

1.3.2 T法 通过Dataviewer软件分析断层图像，将M2牙体长轴与y轴平行，牙合面近远中向长轴与x轴平行，牙合面与z轴平行。测量某位点的CEJ-ABC时，使y轴通过该位点，并在该面测量该处的CEJ-ABC，见图1。

1.4 误差分析 采用标准差(standard deviation， SD)评价不同测量者间及同一测量者的误差。分析不同测量者间采用同一测量方法的误差时，取每名测量者3次测量中第1次的测量结果。

1.5 牙槽骨吸收情况 对不同结扎时间各组(A～D组)小鼠牙槽骨吸收情况进行分析时，取3名测量者采用两种方法测量的平均值作为该组的测量值，观察牙槽骨随时间的变化。

1.6统计学分析 采用SPSS 21.0统计分析软件，数据比较采用两独立样本t检验(正态分布)或Mann-WhitneyU检验(非正态分布)。以P<0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 准确性分析 3名测量者采用同一种测量方法时，R法的SD为35.67 μm，T法的SD为14.24 μm，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。同一测量者采用不同测量方法前后3次测量时，R法SD为34.87 μm，T法的SD为7.82 μm，差异有统计学意义(P<0.05，图2)

2.2 结扎时间对准确性的影响 不同结扎时间各组不同测量者采用T法测量时SD分别为：A组6.06 μm，B组17.42 μm，C组12.39 μm，D组21.11 μm；采用R法测量时SD分别为：A组25.45 μm，B组33.47 μm，C组38.80 μm，D组44.96 μm。不同结扎时间各组同一测量者采用T法测量时SD分别为：A组6.23 μm，B组8.21 μm，C组9.40 μm，D组7.46 μm；采用R法测量时SD分别为：A组24.09 μm，B组32.78 μm，C组38.67 μm，D组43.93 μm。不同结扎时间各组不同测量者间和同一测量者内SD值差异均有统计学意义(P均<0.05，图3)。

2.3 测量位点对准确性的影响 在颊侧，除外M1的BG位点、M2的DBC位点及M3的BG位点，其余各位点不同测量者采用T法测量的SD均较采用R法更小(P均<0.05，图4A)；在腭侧，M1的MPC位点及M2和M3的所有位点，不同测量者采用T法测量的SD均较采用R法更小(P均<0.05，图4B)。同一测量者进行测量时，颊侧及腭侧各位点除颊侧M1的MBC位点外，采用T法测量的SD均小于R法 (P均<0.05，图4)。

2.4牙槽骨吸收随时间的变化 结扎3天时，即发生牙槽骨吸收，且随结扎时间延长逐渐加重，见图5。

3 讨论

曾有学者[13-15]截取牙槽骨的某一截面，在该面上测量CEJ-ABC，此方法为“断层法”。但其中多数研究未明确上颌骨的测量位置。有研究[13-14]尝试调整图像使M1、M2、M3的CEJ与根尖孔处于同一平面进行测量，此方法具有一定的可行性，但由于牙根形态和根尖孔位置的不规则和变异性，实际操作存在困难，误差可能较大。此外，重度牙周炎牙齿移位时，难以使3颗牙的根尖孔处在同一平面。因此，建立一种既不受解剖形态的限制，也不会受牙齿移位影响的测量方法十分必要。本研究中T法选取的标志是目标牙的牙合面近远中向长轴、牙长轴和牙合面，这3个标志不受某个牙尖、沟、嵴、根尖孔等解剖结构变异的限制，也不受牙齿移位的影响。

表1 不同测量方法之间的比较

图5 结扎后当日(A组)、3天(B组)、7天(C组)、28天(D组)不同位点的牙槽骨高度 A.结扎不同时间后上颌骨3D重建图像，比例尺为500 μm； B、C.结扎不同时间采用T法测量颊侧(B)及腭侧(C)各位点的牙槽骨高度

本研究对比R法与T法在测量牙槽骨吸收上的可靠性，发现T法的操作者间误差更小，且同一测量者使用T法测量时产生的误差也明显小于R法，表明T法测量结果的一致性更高、误差更小，也更为可靠。此外，本研究发现T法的测量结果普遍小于R法，可能因为牙周炎牙槽骨骨密度降低，3D图像中与周边骨组织及牙体组织重叠，不够清晰，测量者无法准确判断ABC，导致测量值大于实际值，而断层图像不存在以上问题。

R法的误差来源可能包括4个方面：①无明确的颌骨位置参考线，解剖结构变异导致样本位置不完全一致；②硬组织密度十分接近，CEJ和ABC不清晰；③透视效果导致“远小近大”；④测量时需要进行比例尺以及像素和长度单位的转换，易产生误差。而T法的误差来源主要是CT扫描层厚的限制，层厚越薄，测量值越接近实际值。此外，T法相对于R法有其明显的优势，R法只能测量物体表面“看得见”的结构，而T法可以深入物体内部，测量那些“看不见”的结构，如邻间隙处的CEJ-ABC，根分叉处ABC至根分叉穹顶的距离等。重度牙周炎牙齿移位时，R法中一些位点被遮挡，无法测量，T法可以随时调整，以适应牙齿位置的变化。R法与T法的比较见表1。

综上所述，本组小鼠牙周炎模型实验结果表明T法相对于R法具有明显的优势，可操作性更强，测量结果一致性和稳定性更好。

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Assessment of two methods in evaluating alveolar bone loss by micro-CT based on periodontitis model in mice

CUIDi1,ZHANGYangheng1,ZHANGTing2,WEITingli3,YANFuhua1*

(1.DepartmentofPeriodontology, 2.DepartmentofEndodontics, 3.DepartmentofOralImplant,NanjingStomatologicalHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity,Nanjing210008,China)

Objective To evaluate two methods measuring alveolar bone loss by micro computed tomography (micro-CT) based on periodontitis model in mice. Methods The silk ligatures were tied around the right maxillary second molars of mice to induce periodontitis model. The right half maxillaries of mice model were harvested for micro-CT analysis. Three dentists were recruited for the measurement with two different methods： Modified tomography (T) method and reconstruction (R) method. Accuracy and consistency of each method were estimated by standard deviation (SD). Results The SDs of R method managed by the same operator (measurement for 3 times) or different operators (3 operators) were 34.87 μm and 35.67 μm respectively, while that of T method was 7.82 μm and 14.24 μm respectively. The SDs of T method were significantly lower than those of R method (bothP<0.05). Conclusion T method is more accurate and consistent than R method for evaluating alveolar bone loss in mice periodontitis model.

Alveolar bone loss; Periodontitis; Tomography， X-ray computed

国家自然科学基金(81570982、81371152)、江苏省双创计划引进人才[苏人才办(2014)27]、江苏特聘医学专家资助项目[苏卫人(2014)49号]。

崔迪(1989—)，女，江苏无锡人，硕士，医师。研究方向：牙周病和全身疾病关系。E-mail: cd_nju@163.com

闫福华，南京大学医学院附属口腔医院牙周科，210008。E-mail: fhyan2005@126.com

2016-07-30

2017-01-08

R816.98； 814.42

A

1672-8475(2017)03-0173-05

10.13929/j.1672-8475.201607059