白木香种子脂溶性成分及其抗肝癌活性研究＊

郑 威，崔正嵬，冯 剑，陈德力，刘洋洋

（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室 海口 570311）

白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.为瑞香科沉香属的植物，是国产沉香的唯一正品植物资源，由于自身繁殖率低下，受自然灾害和人为破坏的影响，野生白木香资源已遭受严重的破坏，被列为国家二级濒危保护植物[1,2]。在现有的白木香种子与沉香药材药理研究中发现，二者的部分药理活性表现出一定的相似性，这使得从白木香种子中筛选出具相同药理活性的成分的设想成为了可能，为白木香资源的充分利用提供了理论基础[3-6]。

当前，白木香种子脂溶性成分提取方式的研究主要集中在石油醚浸提法、超临界CO2萃取法、索氏提取法上，而其活性的研究则主要体现在抗氧化和抗菌两个方面[5-9]，水蒸气蒸馏法、快速溶剂萃取法和物理压榨法等方面的研究少见报道。为了系统地比较水蒸气蒸馏法、快速溶剂萃取法、石油醚萃取法、索氏提取法及物理压榨法对白木香种子脂溶性提取物中化学成分及其抗肝癌活性作用的影响，本研究采用GC-MS对5种脂溶性提取物进行成分分析鉴定，同时考察了5种脂溶性提取物对H22小鼠肝癌细胞的抑制作用。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

白木香种子采自海南省海口市演丰镇，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所郑希龙博士鉴定为沉香属白木香Aquilaira sinensis(Lour.)Spreng.的种子，烘干、粉碎、备用。

H22小鼠肝癌细胞（上海歌凡生物科技有限公司）；RPMI Medium 1640（干粉，gibco USA 1786044）；双抗（gibco USA 1832567）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（gibco USA 1798320）。

石油醚（分析级，西陇化工），正己烷（分析级，西陇化工），无水Na2SO4（分析级，上海国药），氯化钠（分析级，上海国药），氯化钾（分析级，上海国药），无水磷酸二氢钠（分析级，上海国药），无水磷酸氢二钠（分析级，上海国药），碳酸氢钠（分析级，上海国药），超纯水为实验室自制。

1.2 实验仪器

快速溶剂萃取仪（ASE350，美国Thermo Fisher）；气相色谱质谱仪联用仪（7890A 5975C，美国Agilent）；倒置荧光显微镜（CKX53，日本-OLYMPUS）；血球计数板（北玻）；酶标仪（Thermo 1510，美国Thermo Fish⁃er）；超纯水系统（CR-Easy15，Heal Force）；台式高速冷冻离心机（TGL-16M，上海卢湘仪）；CO2培养箱（Gal⁃axy 170 s，New Brunswick）。

2 方法

2.1 白木香种子脂溶性提取物的制备

2.1.1 水蒸气蒸馏法（Steam Distillation,SD）

白木香种子粉和超纯水按质量体积比1∶5加入水蒸气蒸馏装置，微沸冷凝回流6 h，吸取上层油层，经无水Na2SO4干燥后，得白木香种子水蒸气蒸馏法所得脂溶性提取物，记作SD-E。

2.1.2 快速溶剂萃取法（Accelerated Solvent Extraction,ASE）

将白木香种子粉和硅藻土以质量比2∶1比例混合均匀后加入样品池中，设定萃取温度120℃，静态萃取时间5 min，静态萃取次数3次，以60%样品池体积正己烷冲洗，氮气吹扫时间2 min，萃取，收集萃取液挥干溶剂并干燥，得白木香种子快速溶剂萃取法所得脂溶性提取物，记作ASE-E。

2.1.3 石油醚萃取法（Petroleum ether Extraction,PE）

取白木香种子粉和95%乙醇按质量体积比1∶5冷浸提取3次，过滤、合并滤液，浓缩至浸膏再经石油醚萃取，收集萃取液，浓缩，得白木香种子石油醚萃取法所得脂溶性提取物，记作PE-E。

2.1.4 索氏提取法（Soxhlet Extraction,SE）

取1/2提取筒体积的白木香种子粉，用滤纸筒装好，封住开口端，置于提取筒内，加入100 mL正己烷，85℃水浴加热提取6 h，收集回流液浓缩至干，得白木香种子索氏提取法所得脂溶性提取物，记作SE-E。

2.1.5 物理压榨法（Physical Squeeze,PS）

将白木香种子粉加入压榨机中压榨取油，收集压榨出来的油分，得白木香种子物理压榨法所得脂溶性提取物，记作PS-E。

2.2 GC-MS分析条件

2.2.1 气相条件

石英毛细管柱HP-5MS（5%Phenyl Methyl Si⁃lox,30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。

程序升温：50℃保持1 min，15℃·min-1至140℃，保持1 min，1℃·min-1至160℃，保持2 min，5℃·min-1至250℃，保持 5 min，最后 18℃·min-1至 285℃，保持2 min。气化室温度250℃，载气为氦气，流速1 mL·min-1，不 分流。

2.2.2 质谱条件

EI源，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离电压70 eV，全扫描模式，溶剂延迟时间6 min，进样量1 μL。

2.2.3 GC-MS数据处理方法

采用Chemstation软件解卷积后，由NIST谱库自动检索并结合人工检索确定各成分，再通过面积归一法计算获取各成分的相对百分含量。

2.3 H22小鼠肝癌细胞生长抑制率测定[10]

分别取白木香种子的5种脂溶性提取物10 mg，加10 μL的DMSO超声溶解，用完全培养基稀释配制成10 mg·mL-1的储备溶液，用时再稀释成1 mg·mL-1的样品溶液。

挑选对数生长期的H22小鼠肝癌细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，1 000 r·min-1离心吸取上清，用完全培养基重悬并稀释细胞浓度至5×104个/mL，按照每孔100 μL接种到96孔板，周围孔用PBS填充，防止边缘效应，于37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。

实验设置阴性对照组（正常生长的细胞不加药物）、调零组（只加培养液）及样品组3组，每组设置5个复孔，样品组每孔加100 μL的样品液，对照组和调零组加100 μL的培养液。37℃，5%CO2继续培养24 h后，每孔加10 μL的MTT溶液继续孵育4 h，吸去上清加150 μL的DMSO溶液，酶标仪振荡10 min后在570 nm下测量吸光度，并取吸光度的平均值计算抑制率。

表1 不同提取方法所得的白木香种子脂溶性提取物得率表

3 结果

3.1 不同提取方法所得的白木香种子脂溶性提取物得率（%，w/w）比较

3.2 不同提取方法所得的白木香种子脂溶性提取物成分分析

采用GC-MS联用技术对白木香种子的5种脂溶性提取物进行成分检测，获取相应的脂溶性成分的总离子流图（图1-5）。

图1-5不同提取方法所得白木香种子脂溶性提取物成分数据经面积归一法计算，SD-E、ASE-E、PE-E、SE-E和PS-E中化学成分相对百分含量大于1%的成分个数依次为19、9、19、13和3个；其相对百分含量占总含量分别为78.25%、94.38%、90.93%、88.38%、91.46%，具体数据如表2所示。

由表2可知，白木香种子的5种脂溶性提取物中均含有较多的不饱和脂肪酸和烯烃类物质，SD-E中不饱和脂肪酸为油酸（3.43%）、反油酸（7.26%），烯烃类成分为8-十七碳烯（1.09%）、β-瑟林烯（2.85%）、2-异丙基-5-甲基-9-亚甲基-双环[4.4.0]癸-1-癸烯（4.53%）；ASE-E中不饱和脂肪酸为油酸（2.93%）、反油酸（54.79%）、6-十八碳烯酸（1.69%），烯烃类物质为角鲨烯（9.21%）；PE-E中不饱和脂肪酸为油酸（14.88%）、反油酸（6.17%）、6-十八碳烯酸（1.59%）、顺-6-十八碳烯酸（2.00%）、十八碳-9-烯酸（1.09%）、顺式-十八碳烯酸（1.44%），烯烃类物质为4,11,11-三甲基-8-亚甲基-二环[7.2.0]4-十一烯（2.94%）、葎草烯（2.97%）、1,9-十四碳二烯（4.36%）、10-二十一（碳）烯（c,t）（1.50%）、9-十九碳烯（2.67%）；SE-E中不饱和脂肪酸为油酸（1.62%）、反油酸（18.01%），烯烃类物质为（E）-5-十八烯（2.14%）、角鲨烯（43.96%）；PS-E中不饱和脂肪酸为反油酸（48.45%），烯烃类物质为角鲨烯（6.01%）。其他占各提取物相对含量较高的有：SD-E中的5,5-二甲基-4-[3-甲基-1,3-丁二烯基]-1-氧杂[2.5]辛烷（12.11%）和棕榈酸甲酯（17.56%），ASE-E中的棕榈酸（13.12%），PE-E中的9-十六碳烯酸乙酯（11.24%）和油酸甲酯（13.76%）以及PS-E中的棕榈酸（37.00%）相对百分含量都超过了10%，5种提取物中反油酸均有较高含量。

图1 SD-E气相色谱总离子流图

图2 ASE-E气相色谱总离子流图

图3 PE-E气相色谱总离子流图

图4 SE-E气相色谱总离子流图

图5 PS-E气相色谱总离子流图

表2 不同提取方法所得的白木香种子脂溶性提取物化学成分表

表3 不同提取方法所得的白木香种子脂溶性提取物癌细胞增殖抑制率表

3.2 抗肝癌活性测定结果

采用MTT法，白木香种子提取物在1 mg·mL-1的浓度下对H22小鼠肝癌细胞增殖的抑制率如表3所示：

4 讨论

本研究采用GC-MS分析比较了白木香种子脂溶性提取物的化学成分，发现了具安定作用的沉香螺醇[11]，具抗氧化、抗肿瘤、抗辐射及抗菌多重效果的角鲨烯[12]，具抗肿瘤活性的棕榈酸[13]，具诱导细胞凋亡活性的反油酸[14]、以及被广泛应用的油酸等成分。5种提取方法所得的脂溶性提取物的得率和成分都存在较为显著的差异。石油醚萃取法较物理压榨法所得成分更具有多样性，含有5类共计19种成分，占总量的90.93%，物理压榨法所提成分较少，相对百分含量在1%以上仅棕榈酸（37.00%）、反油酸（48.45%）、角鲨烯（6.01%）3种，二者得率分别为36.31%和40.12%，水蒸气蒸馏法和索氏提取法都含有饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、酯类、烷烃、烯烃、醛类以及醇类7类成分，二者得率分别为0.009 6%和48.88%，前者作为常用的挥发性物质提取方法，所提取的组分最多，成分分布更为全面，索式提取法则以反油酸和角鲨烯为主要成分，根据这4种提取方法的原理可知，造成它们两两之间差异的影响因素可能为提取溶剂；快速溶剂萃取法萃取过程较之索氏提取法等其它四种提取方法，其所需温度和压力更高，提取成分主要包括饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、酯类、烯烃4类，以棕榈酸、反油酸、反油酸甲酯和角鲨烯为主要成分，占总量的82.17%，提取物得率为37.36%，说明不同提取方法之间成分的溶出与提取的温度和压力有一定的依存关系。结合现有的研究[15-17]可以发现，植物成分的提取与温度、提取溶剂及压力等因素呈一定的相关性，不同的提取溶剂、温度及压力对提取物的得率和成分有较为显著的影响，因此，今后对白木香种子脂溶性成分提取方法的选择应多因素考虑，参考各提取方式的提取效果，根据自身所需选择最佳提取方法。

H22小鼠肝癌细胞的体外生长抑制实验表明，白木香种子脂溶性提取物对H22小鼠肝癌细胞的增殖具有一定的抑制作用，不同提取方式所得的白木香种子脂溶性提取物对H22小鼠肝癌细胞的抑制能力依次为ASE-E＞SE-E＞PS-E＞SD-E＞PE-E。对5种脂溶性提取物成分的分析结果进行整合时发现，各提取物中反油酸和角鲨烯的相对百分含量之和与相应的细胞抑制作用呈线性相关，结合已有研究[12,14]推测，角鲨烯和反油酸可能是白木香种子脂溶性提取物对H22小鼠肝癌细胞生长起抑制作用的主要成分，前者对羟基—甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶活性的抑制和自由基清除或活性氧的作用，后者对细胞凋亡诱导的活性可能是对H22小鼠肝癌细胞生长起抑制作用的关键性因素。白木香种子脂溶性提取物成分复杂，其药理活性的具体作用机制尚不明确，有待于进一步深入研究。本研究明确了白木香种子脂溶性提取物的物质基础，也为白木香种子的利用和抗肝癌药物开发提供了新提示。

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