甘蔗新品种桂糖47号的组织培养技术研究

刘红坚，李松，游建华，何为中，刘俊仙，卢曼曼，刘丽敏，余坤兴，刘欣

（广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁530007）

甘蔗新品种桂糖47号的组织培养技术研究

刘红坚，李松，游建华，何为中*，刘俊仙，卢曼曼，刘丽敏，余坤兴，刘欣

（广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁530007）

以桂糖47号为材料，以MS基本加外源激素浓度梯度进行试验处理设计，对品种的愈伤诱导、愈伤分化、试管苗增殖和生根阶段进行培养基筛选试验，以期筛选出最合适桂糖47号的培养基配方。试验结果表明：优化的桂糖47号愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 2.5mg/L；愈伤组织分化培养基为MS+BA 1.0mg/L；增殖培养基为MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L；生根培养基为1/2 MS+NAA 5mg/L，生根最好，苗绿、比较高，长势好，对加快甘蔗新品种桂糖47号在广西蔗区大面积推广种植起到积极的作用。

甘蔗；桂糖47号；组织培养

常规的甘蔗加速繁殖系数低，1年仅增加种量15～20倍，极大地限制了甘蔗新品种的迅速推广和应用[1]。利用甘蔗组培技术实现工厂化育苗已成为快速繁殖推广应用甘蔗良种的有效途径[2]。同时甘蔗组培技术作为一种有效的脱毒技术[3-7]，它可以把蔗株上的花叶病、宿根矮化病等用常规方法难以防治的病害减弱，生产健康种苗用于生产，增产增糖效果明显。桂糖47号是广西农业科学院甘蔗研究所育成的新品种，亲本为：粤糖85-177×CP81-1254，早熟，高糖，丰产，宿根性好，有效茎多，抗病性、抗倒性和宿根性好，是个有推广潜力的新品种，为了加快繁殖这个优良新品种，我们采用了组织培养的方式对其进行快速繁殖，加快桂糖47号新品种的大面种推广。桂糖47号的高效组织培养技术没有报道，本研究通过筛选愈伤诱导、愈伤分化、增殖、生根培养基，研制出适合桂糖47号的高效组织培养技术。

1 材料与方法

1.1 供试材料

在晴天上午，选取无病虫害、生长健壮的桂糖47号蔗茎梢部作外植体，蔗茎梢段剥除2～3层外叶鞘，切取长约15 cm的茎段，用75%酒精擦洗外部及两端切口置超净工作台上，再用75%酒精擦洗1次供接种用。

1.2 试验设计

1.2.1 愈伤组织诱导试验在愈伤组织诱导阶段选取MS作为基本培养基，添加不同浓度的2，4-D，分别是1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mg/L，每处理3个重复，每个重复60瓶，培养10d后统计愈伤组织生长情况，计算公式：愈伤组织诱导率（%）=诱出愈伤组织瓶数/（接种总瓶数-污染瓶数）×100%

1.2.2 分化培养试验从愈伤分化出小苗阶段选用不同浓度的细胞分裂素会对小苗分化产生不同的影响，在试验中选用的细胞分裂素为6-苄基腺嘌呤（6-BA），生长素为萘乙酸（NAA），试验设：①MS+BA 0.5mg/L+ NAA 0.01mg/L；②MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L；③MS+BA 1.5mg/L+NAA 0.01mg/L；④MS+BA 2.0mg/L+ NAA 0.01mg/L；⑤MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.01mg/L。每处理3个重复，每个重复60瓶，培养15d后统计出现绿芽愈伤组织数量，计算公式：分化率（%）=绿芽愈伤组织瓶数/（接种总瓶数-污染瓶数）×100%

1.2.3 第3～4代甘蔗苗增殖试验在增殖培养基中添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA），试验设计不同处理培养基：①MS；②MS+BA 0.4mg/L+NAA 0.05mg/L；③MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L；④MS+BA 1.6 mg/L+NAA 0.05mg/L；⑤MS+BA 3.2mg/L+NAA 0.05mg/L。每处理3个重复，每个重复120瓶，培养20d后调查株高、茎径，统计增殖苗数和增殖继代系数。

增殖继代系数（倍）=增殖后总苗数/增殖基数

1.2.4 生根培养试验生根阶段不同浓度生长素萘乙酸（NAA）对桂糖47号增殖苗生根有不同的效果。本试验设计不同浓度的生根培养基4处理，A：1/2 MS+NAA 2.5 mg/L；B：1/2 MS+NAA 5.0mg/L；C：1/2MS+ NAA7.5mg/L；D：1/2 MS+NAA 10.0 mg/L。每处理3个重复，每个重复75瓶，培养21天后统计生根数、生根率、平均根数、平均根长都是以接种后21d计算。观察各不同培养基处理之间生根率的差异。

生根率（%）=（21d生根瓶数-污染瓶数）/接种总瓶数×100%

平均根数=每瓶根数相加/生根瓶数；平均根长=每瓶根长相加/生根瓶数

1.3 培养条件

所有材料接种后均置于实验室中进行培养，培养条件为：愈伤组织诱导阶段为暗培养；分化和增殖、生根阶段为光培养，光照强度为2000 lx。培养室内温度为28±2℃。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

从表1可以看出，6种不同浓度的2，4-D对桂糖47号愈伤组织的诱导率相差很大。2，4-D浓度在1.0时平均诱导率才有36.63%，当2，4-D浓度在1.0～2.5mg/L递增时，甘蔗愈伤组织诱导率也递增，2，4-D浓度达到2.5 mg/L时诱导率达到93.64%，其愈伤组织诱导率高于其它浓度处理，愈伤组织诱导率与其它处理的差异达到极显著水平，诱导出的愈伤组织乳白色，结实不松散，色泽鲜。2，4-D浓度达到3.0mg/L、4.0mg/L时，诱导率有所下降，而且愈伤组织出现水渍状，松散，色暗，长得不好，所以桂糖47号诱导愈伤组织，培养基中添加的2，4-D浓度为2.5 mg/L时最佳。

2.2 分化培养

桂糖47号愈伤组织分化成苗受到6-苄基腺嘌呤（6-BA）细胞分裂素的影响。从表2可以看出，添加不同浓度的细胞分裂素6-BA，诱导分化成苗的结果不一样，培养基①中加入的BA 0.5 mg/L时分化率是53.5%，②中BA1.0 mg/L处理的分化率达到93.6%，高于其它6-BA浓度处理，并且分化率与其它浓度处理的差异达到极显著水平，该处理分化出的小苗数多，绿且壮。处理③和处理④的平均分化率分别达到91.9%和88.2%，但两者间的分化率差异没有达到显著差异水平，其分化率略低于处理②，高于处理①和处理⑤；然而随着6-BA浓度的增大，分化率有所下降，且因为6-BA的浓度过高，分化出的小苗叶子有水渍玻璃状，生长势不好，因此桂糖47号愈伤组织分化小苗选用②号培养基是绿苗分化阶段比较理想的组合浓度。

2.3 增殖培养

不同浓度的6-苄基腺嘌呤（6-BA）对桂糖47号增殖苗株高、茎径、增殖系数有影响（见表3）。从表3可知，各处理株高由大到小顺序为处理③＞处理②＞处理①＞处理⑤＞处理④，且处理③的株高与其它处理株高的差异达到极显著水平，处理②与处理①的株高差异不显著；各自处理的平均茎径差异不显著;各处理增殖系数由大到小顺序为处理③＞处理④＞处理②＞处理⑤＞处理①，且处理③的增殖系数与其它处理的差异达到极显著水平，处理④、处理②和处理⑤的增殖系数间差异不显著。桂糖47号的组培苗增殖快，苗细，株高总体都不高，偏矮，茎径偏细，不够壮，综合来看，长势最好的是③号培养基，其次是②号培养基，③号培养基最适宜桂糖47号增殖培养。

2.4 生根培养

NAA为生长素类激素，低浓度时可以促进生长点生长，高浓度时则可以促进生根[8]。本试验用不同浓度的NAA对桂糖47号诱导生根，分别于接种后21d调查生根情况（见表4），不同NAA浓度培养基的生根诱导效果差异较大，各处理出根率的排列顺序为培养基B＞培养基C＞培养基D＞培养基A，且培养基B的生根率与其它处理的差异达到极显著水平，培养基C和培养D生根率间的生根率差异不显著，但比培养基A高，且差异达到极显著水平；平均根长由长到短的排列顺序为培养基B＞培养基D＞培养基C＞培养基A，而培养基B，D和C间的根长差异不显著，但3个处理的根长与培养基A的差异都达到了极显著水平。在本试验过程中发现桂糖47号很容易诱导出根，发根时间早，而且根的数量多。当A处理培养基中加入的NAA浓度为2.5mg/L时，生根率比较低，根的数量少，根短。NAA浓度的增加到5.0mg/L时（B处理），桂糖47号生根率最高，发根早，根壮、平均根多，最适宜种植。当NAA浓度达到7.5～10mg/L时（C、D处理），苗的生根率也可以，根数也多，但是根比较细，根总体质量比较弱，影响苗的成活率。为了得到健壮的假植苗，桂糖47号生根培养基选择B（1/2 MS+NAA 5.0mg/L）时，生根最好，发根快，根壮、根多。

表1 不同浓度2,4-D对桂糖47号愈伤组织诱导率的影响Table 1. The effect of 2,4-D on callus induction rate of Guitang 47

表2 6-苄基腺嘌呤(6-BA)对桂糖47号绿苗分化的影响Table 2. The effect of 6-BA on green seedlings differentiation of Guitang 47

表3 6-苄基腺嘌呤(6-BA)对桂糖47号绿苗增殖的影响Table 3. The effect of 6-BA on green seedlings multiplication of Guitang 47

表4 不同NAA浓度对桂糖47号生根的影响Table 4. The effect of different NAA concentration on rooting of Guitang 47

3 小结与讨论

甘蔗是一种含多元酚类较高的作物，尤其是幼嫩茎尖和嫩叶鞘含量更高。在进行组织培养时，制备外植体和继代过程中细胞受到破坏，细胞内的多元酚类化合物与多酚氧化酶接触，将酚氧化成棕色的对细胞有害的醌类物质，醌类富集越多，颜色越深，褐化越严重，细胞正常生理受到破坏就越严重，严重时还通过扩散污染培养基，这就是所谓的酚为害或酚污染[9]。

在本试验过程中发现在整个组培过程中均存在酚污染，对愈伤组织的诱导影响比较大，因为在接种愈伤时切面伤口比较大，所以诱导愈伤组织时必须放在暗培养室中培养，而且时间不宜过长，一般诱导培养7～10d，转分化培养基，诱导愈伤组织分化成小苗。培养基中添加的2，4-D浓度直接影响愈伤组织的诱导率，诱导桂糖47号愈伤组织的最适培养基为MS+2，4-D 2.5mg/L。6-BA浓度影响愈伤组织分化成小苗，桂糖47号愈伤组织分化培养基为MS+BA 1.0 mg/L，诱导出小苗数最多。

桂糖47号增殖培养时，培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA配比，才能得到较高的增殖系数。在试验过程中发现桂糖47号增殖快，增殖苗矮，苗细。通过反复筛选，增殖培养基为MS+BA 0.8mg/L+NAA 0.05mg/L，苗绿、增殖系数高，苗比较高，长势好。

桂糖47号很容易发根，培养基中NAA浓度达到5.0 mg/L，发根早，发根数多，根壮，根布满瓶底。

通过本技术加快桂糖47号的离体繁殖速度，对加快桂糖新品种桂糖47号在广西大面积推广种植会起到积极的作用。

[1]李海明，潘世明，李瑞美，吴松海.甘蔗组织培养中褐变的研究进展[J].甘蔗糖业，2003（4）：18-21.

[2]侯朝祥，赵培方，刘家勇，等.影响甘蔗茎尖组培苗假植成活质量的几个因素分析[J].中国糖料，2010，32（1）：40-41，43.

[3]李松，余坤兴，刘丽敏，等.甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术研究[J].中国糖料，2010，32（4）：1-5，8.

[4]周明强，易代勇，班秀文，龚德勇，刘凡值.甘蔗脱毒种苗培育技术研究[J].贵州农业科学，2006，34（1）：47-49.

[5]肖关丽，杨清辉，李富生，杨生超.甘蔗脱毒种苗组织培养技术研究[J].中国种业，2003（2）：27-28.

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[7]刘丽敏，李松，戴友铭，余坤兴，刘红坚，淡明.甘蔗茎尖脱毒培养技术研究[J].中国糖料，2009，31（2）：18-20.

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[9]秦廷豪，邹宗兰，吴才文.浅析甘蔗组培中的酚害[J].甘蔗，1997，4（2）：12-14.

Study on The Tissue Culture of New Sugarcane Variety GT47

LIU Hong-jian,LI Song,YOU Jian-hua,HE Wei-zhong*,LIU Jun-xian,LU Man-man, LIU Li-min,YU Kun-xing,LIU Xin
（Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007）

GuiTang 47 as material and MS basic medium plus different exogenous hormone concentration as gradient,in order to screen optimized medium component,screening medium was in the callus induction phase, callus differentiation phase,multiplication phase and rooted phase,respectively.The results showed that：optimizing callus induction medium was MS+2,4-D 2.5 mg/L；callus differentiation medium was MS+BA 1.0 mg/ L；multiplication medium was MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.05 mg/L;rooted medium was 1/2 MS+NAA 5 mg/L, under the condition,seedlings grew well，radication was better,meanwhile,seedling was greener and taller,which plays a positive role in improving area of the Guitang 47 in Sugarcane planting area in Guangx

sugarcane;GuiTang 47;tissue culture

S566.1

A

1007－2624（2017）02－0006－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.002

2016-12-26

国家星火计划（2015GA90007）；广西农业科学院科技成果转化基金（农成转2015001）和广西农业科学院科技发展基金（2015JZ04）。

刘红坚（1976-），女，广西南宁市人，助理研究员，主要从事甘蔗组织培养技术和理化诱变育种研究。E-mail：blackjacket@126.com

何为中（1965-），男，研究员。