维甲酸对脑出血大鼠LINGO—1表达的影响

梁顺利　吴忧　张荣博　章水晶　徐彬

[摘要]目的 观察脑出血后LINGO-1表达的变化，探讨维甲酸对脑出血后LINGO-1表达的影响。方法 将72只SD大鼠随机分为假手术组，模型组和维甲酸治疗组，选取造模后1d，3d，7d和14d为观察点。制备脑出血模型，Longa评分法评价神经功能缺损程度，RT-PCR法检测LINGO-1 mRNA的表达，Western blot法检测LINGO-1蛋白的表达。结果 模型组Longa 评分7d最高，14d出现下降；LONG-1 mRNA 3d表达最高，7～14d出现下降；LONG-1蛋白7d到高峰，14d出现下降。维甲酸治疗组在14d Longa评分较模型组下降（P<0.05）；在7d和14d LINGO-1mRNA表达较模型组下降（P<0.05）；在14d LINGO-1蛋白表达较模型组下降（P<0.05）。结论 脑出血后LINGO-1表达明显上调，呈先上升后下降的变化规律。维甲酸可以降低LINGO-1 mRNA和蛋白的表达及神经功能评分。

[关键词] 含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的勿动蛋白受体作用蛋白；脑出血；维甲酸；神经再生

中图分类号：R743.3 文献标识码：A 文章编号：1009-816X

[Abstract] Objective To explore the effect of retinoic acid on expressions of LINGO-1 in rats after intracerebral hemorrhage （ICH）. Methods 72 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， and retinoic acid group. Observation was made at 1，3，7，14d after ICH. Neurological functional recovery was evaluated by Longas score； RT-PCR and Western blot were applied to detect the changes in the expressions of LINGO-1 mRNA and protein. Results Longas score and LINGO-1 protein were decreased at 14d after ICH in retinoic acid group compared with those in model group（P<0.05）。 The LINGO-1 mRNA was decreased at 7d and 14d after ICH in retinoic acid group compared with model group（P<0.05）. Conclusions The decreased expressions of LINGO-1 and neurological score induced by retinoic acid might be one of the mechanisms of neural function recovery after ICH.

[Key words] LINGO-1； Intracerebral hemorrhage； Retinoic acid； Nerve regeneration

脑出血（Intracerebral hemorrhage， ICH）是一种常见的神经系统疾病，最终导致持久的功能损害，其原因为中枢神经损伤后再生能力的缺乏。近年研究发现勿动蛋白（Nogo）与神经再生障碍有关，抑制Nogo或受体复合物可以促进轴突的生长[1]。含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白（Leucine rich repeat and Ig domain containing， Nogo receptor interacting protein， LINGO-1）是Nogo受体复合物中的一种重要的跨膜蛋白，负向调节少突胶质细胞分化，轴突再生， 髓鞘形成和神经元存活[3]。研究表明抑制LINGO-1的表达能延长神经轴突和改善神经功能。维 甲酸（retinoic acid，RA） 是脂溶性维生素A的衍生物，在缺血性卒中和脊髓损伤的研究中能抑制LINGO-1的表達，促进神经功能恢复，但LINGO-1在ICH方面的研究甚少。本研究观察RA对ICH后LINGO-1表达的影响，旨在探讨LINGO-1在ICH中的可能作用及维甲酸对ICH的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组：清洁级雄性成年SD大鼠72只，体重180-220g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分三组，即假手术组（n=24），模型组（n=24）和RA治疗组（n=24）。

每组又分为术后1d，3d，7d，14d四个小组，每小组各6只。

大鼠脑出血模型制备： 参照Yang[4]报1.2 道的方法：术前4 h禁食不禁水，称重后用10%

水合氯醛按350mg/kg腹腔麻醉，俯仰立体定向仪上并固定，用微量注射器从大鼠近尾段的尾动脉抽取50？l新鲜不凝血，在立体定向仪引导下按20？l/min的速度缓慢匀速缓慢注入左侧尾状核（前囟前0.2mm，左侧中线旁开3mm，深度5mm）。注血结束后留针15min等血液凝固后慢慢拔针，保温至苏醒后分笼喂养。假手术组在相同部位缓慢注入50？l生理盐水，其余步骤同上。RA治疗组RA用二甲基亚砜溶解成浓度为3mg/ml的溶液，于造模成功后腹腔注射，每只大鼠每天10mg/kg，连用14d；模型组每只大鼠每天3.3ml/kg的生理盐水腹腔注射；假手术组术后不做任何处理。

1.3 LINGO-1 mRNA检测： 采用RT-PCR法检测：脑组织取自出血灶周，所得RNA用紫外线分光光度计定量测量RNA浓度。逆转录合成cDNA：反应体积10μl，37 ℃孵育15 min，85 ℃，5 s 终止反应，灭活反转录酶。引物序列如下：LINGO-1 引物序列为上游5-GCCACCTGGTCTATCT CCGTTTC-3，下游5-GCAGGTAATTGAGCCCACGAAA G-3（162 bp）。内参ACTIN 上游5-CG TTGACATCCGTAAAGACCTC-3，下游5-TAGGAGC CAGGGCAGTAATCT -3（110 bp），均由武汉谷歌生物有限公司设计合成。反应条件：94 ℃预变性3 min，进入循环94 ℃变性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，35 个循环，最后72 ℃延伸5min。RT-PCR 产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条带用美国Quantity-one凝胶图像处理系统分析，计算目的条带和内参照吸光度比值。

1.4 LINGO-1蛋白检测：采用Western blot法检测 ：出血灶周脑组织在PBS中匀浆，离心，加入裂解液后置于冰上不断搅拌，后于4 ℃离心8 min，上清液用3倍缓冲液稀释，100℃煮5min制样，用于SDS-PAGE。将胶上的蛋白转移到PVDF膜，用1% 酪蛋白封闭液封闭膜1h，在0.5%封闭液稀释的一抗中4℃过夜。洗膜后在HRP标记的二抗摇床孵育2h，漂洗后在化学发光溶液中显色，用ChemiDoc XPS 系统扫描，用Image Lab 4.0图像软件测量LINGO-1蛋白和β-actin 蛋白各显色条带的平均光密度比值。

1.5 神经功能评分：参考 Longa[5]评分标准，在造模成功后1d，3d、7d、14d分别对各组大鼠进行神经功能评分。0 分：无神经缺损症状。1 分：提尾悬空时对侧前肢呈屈曲，不能完全伸展。2 分：行走时向对侧转圈。3 分：站立时向对侧倾倒。4 分：不能自行行走，意识下降。0分和4分大鼠不纳入模型组和RA治疗组，假手术组评分不限。当大鼠数量减少时再按随机方法予以补足每组大鼠数。

1.6 统计学处理：用SPSS18.0版软件统计分析，数据用均数±标准差（（）表示，统计方法用单因素方差分析，组组比较方差齐者用LSD法，RA治疗组各时间点对LINGO-1蛋白表达与Longa评分进行Pearson相关性分析， P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能Longa评分：假手术组Longa评分均低，各时间点比较无统计学差异（P>0.05）；模型组与假手术组比较，各时间点Longa评分均增高，均有统计學差异（P<0.05），且7d时间点表达量最高，14d出现下降；RA治疗组与模型组比较，在1d，3d，7d时间点，Longa评分差异无统计学意义（P>0.05），在14d时间点，Longa评分下降明显，差异有统计学意义（P<0.05），提示14天RA治疗组较模型组神经功能恢复程度较好，见表1。

2.2 LINGO-1 mRNA：表达变化：假手术组LINGO-1 mRNA仅少量表达，各时间点比较无统计学差异（P>0.05）；模型组1d，3d，7d及14d LINGO-1 mRNA 表达与假手术组相比均明显升高（P<0.05），3d 时间点表达最高，7d至14d 表达呈下降趋势；RA治疗组LINGO-1 mRNA表达，在1d和3d时间点与模型组比较无统计学差异（P>0.05），在7d和14d 时间点较模型组降低，有统计学差异（P<0.05），见表2。

2.3 LINGO-1蛋白表达变化：假手术组LINGO-1蛋白表达量少，各时间点比较无统计学差异（P>0.05）；模型组1d，3d，7d及14d LINGO-1蛋白表达与假手术组相比均明显升高（P<0.05），且在7d达高峰，14d出现下降；RA治疗组LINGO-1蛋白表达，在1d和3d时间点与模型组比较无统计学差异（P>0.05），在7d和14d 时间点较模型组降低，有统计学差异（P<0.05），见表3。

3 讨论

ICH是临床常见脑血管病，致死致残率高。中枢系统损伤导致神经轴突不能再生，最终遗留神经功能障碍。而神经轴突的再生与髓鞘相关抑制因子有关。研究表明[6]：髓鞘相关抑制因子与勿动蛋白受体（Nogo receptor， NgR）复合物相结合，激活RhoA激酶，使细胞骨架发生动力学改变，进而引起神经轴突的生长锥溃变，从而抑制轴突再生和延长。进一步研究表明[7]：LINGO-1是连接髓鞘抑制信号与NgR复合物的纽带。LINGO-1为中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）专有蛋白，高度表达于CNS神经元和少突胶质细胞。LINGO -1的主要功能有以下几个方面[8]：（1）抑制轴突再生；（2）抑制少突胶质细胞分化和髓鞘形成；（3）抑制神经元存活。在缺血性卒中LINGO-1表达上调，而在出血性卒中，LINGO-1表达是否上调仍不清楚。本研究结果显示ICH后LINGO-1 mRNA表达于1d开始增加，3d 到达高峰，7d开始下降，14 d 进一步下降。3d前的上升考虑为出血性脑损伤后神经元的应激反应及炎性因子的刺激所致，7d～14d下降考虑为血肿的吸收期，应激和炎性因子刺激减少，LINGO -1 mRNA相应降低。相对应的LINGO-1 蛋白表达于1d开始增加，7d到达高峰，14d的逐渐下降。简而言之，在出血周边区，LINGO-1的表达随血肿的出现上升，随血肿的吸收出现下降，但仍高于假手术组。推测ICH早期特别是3d-7d LINGO-1高水平维持可能是ICH后神经再生障碍的原因之一。

RA是脂溶性维生素A的衍生物，是核受体中维甲酸受体（RAR）的配体，并能通过血脑屏障到达受损的神经细胞产生效应。Puttagunta等[9]研究证实RA-RAR通路与NgR复合体通路在神经轴突再生和延长的直接关系。CNS受损后，RA和RAR结合，再与LINGO-1启动子上的维甲酸反应成分（ RARE） 结合，抑制LINGO-1表达，促进神经轴突生长，起到改善神经功能的作用[9]。在脊髓损伤和缺血性卒中的研究中使用RA治疗，均能抑制LINGO-1的表达，促进神经轴突的生长和神经功能的恢复[10，11]。本研究结果显示：与模型组比较，RA治疗组神经功能Longa评分在14d出现明显下降，LINGO-1 mRNA的表达在7d和14d出现明显下降，LINGO-1蛋白的表达亦在14d出现明显下降，且LINGO-1蛋白水平与Longa评分行相关性分析示两者强相关。提示RA治疗作用可能是通过抑制了LINGO-1mRNA和蛋白的表达，抑制RhoA激活，减少RhoA激酶的活化，促进脑出血周围神经轴突的再生和延长，进而促进神经功能的改善，为RA在ICH中的应用提供了依据。

参 考 文 献

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