RECQL基因沉默对HCC细胞株体外增殖的抑制作用

张静静 赵妍妍 许雅思 黄海琇 朱鲁程 马胜林 张仕蓉

RECQL基因沉默对HCC细胞株体外增殖的抑制作用

张静静 赵妍妍 许雅思 黄海琇 朱鲁程 马胜林 张仕蓉

目的 观察RECQL基因沉默表达对人肝细胞癌 (human hepatocelullar carcinoma,HCC)细胞株体外增殖的影响,探讨RECQL作为肝癌治疗潜在靶向基因的可能性。方法 以BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761 HCC细胞为研究对象，采用Western blot和免疫组化法观察解旋酶RECQL蛋白的表达情况，通过RNA干扰技术抑制RECQL表达，测定HCC细胞和正常肝细胞（THLE-2细胞）的存活率和死亡率，并采用Western blot法分析凋亡相关蛋白的变化，FACS法检测细胞周期分布。 结果RECQL蛋白在BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B中为阳性表达，SNU-761中为阴性表达。RECQL-siRNA在阳性表达组中抑制HCC细胞的增殖，引起细胞存活率降低和死亡率增加（均P＜0．01），但对阴性表达组和THLE-2细胞存活率和死亡率无影响（均P＞0．05）。RECQL-siRNA处理的SK-HEP-1细胞中，剪切型凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达变化不大，而G2/M期细胞的比例明显增加（P＜0．05或0．01）。结论RECQL基因沉默表达可以抑制HCC细胞的增殖，且这种抑制作用依赖于RECQL的高表达，并对正常肝细胞无影响，其可能机制是阻滞细胞G2/M期，可以作为治疗肝癌的潜在靶向基因。

RECQL 人肝细胞癌 细胞凋亡 细胞周期

人肝细胞癌（human hepatocellular carcinoma,HCC）是世界范围内癌症相关死亡的第三大原因，是最常见的肝癌类型[1]。国内肝癌患者的5年生存率较低，是继肺癌之后的第二大肿瘤死因[2]，目前还未鉴定出确实有效的HCC治疗靶向基因。人类RecQ解旋酶家族包括RECQL（也称为RECQ1或 RECQL1）、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5β5个成员，其中BLM、WRN和RecQ4的遗传缺陷分别会引发面部红斑侏儒综合征、沃纳综合征、先天性血管萎缩皮肤异色病等[3-4]，且RecQ相关疾病多伴基因组不稳定性增加和高风险的癌症易感性[5-6]。RECQL作为人类中表达丰度最高的RecQ蛋白，在许多肿瘤中高表达[7]，参与DNA复制应激反应、端粒维持、DNA损伤修复、肿瘤发生、发展等。最近研究表明，RECQL的突变易致家族性乳腺癌，因此RECQL现在被认为是新的乳腺癌易感基因[4,8-10]。RECQL在肝癌中的研究还相对较少，本研究通过观察其在不同HCC细胞中的蛋白表达情况，采用RNA干扰技术抑制其表达，探讨RECQL对HCC细胞增殖、生长、凋亡和周期分布等的影响，为临床治疗RECQL的靶向药物潜力提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1 材料 4种 HCC细胞 BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761和正常肝细胞THLE-2均购自中科院上海细胞库，采用RPMI-1640培养基（其中含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2 mM谷氨酰胺，均购自美国Gibco公司），并置于5%CO2、37℃培养箱（型号3110，美国ThermoFisher公司）中培养。靶向RECQL mRNA的siRNA（21bp）和无关序列均由上海生工公司合成。所有siRNA序列在3′末端具有突出的3′-dTdT，siRNA靶向的具体序列如下[11-12]：

1.2 方法

1.2.1 细胞转染 根据转染序列不同将细胞分为3组，即空白对照组：不作任何处理，阴性对照组：转染无关序列（Scramble siRNA），干扰组：转染RECQL siRNA（RECQL siRNA-KD1～5）。将HCC细胞和和正常肝细胞以2× 105个/孔接种于6孔板中，继续培养至细胞生长达到约70%密度时，按照Lipofectamine ⓇRRNAiMAX（美国Invitrogen公司）制造商说明分别转染细胞，24h或48h后进行后续实验检测。

1.2.2 蛋白印迹（Western blot）法 收集细胞沉淀，用预冷PBS洗涤后加入NP-40裂解液中，提取总蛋白进行电泳，电转移至NC膜上，依次孵育一抗和对应二抗，洗膜，用Li-Cor Odyssey V3.0红外双色激光扫描成像系统（美国LICOR公司）检测蛋白信号。一抗包括RECQL（美国Santa cruz公司，75kDa，1∶1 000）、GAPDH（美国Proteintech公司，36kDa，1∶5 000），以及凋亡相关蛋白PARP、cleaved-PARP（美国Abcam公司，113 kDa，1∶1 000）、cleaved-caspase-3（美国Abcam公司，17 kDa，1∶1 000）。

1.2.3 免疫组化染色 将无菌圆形盖玻片置于12孔板中，后经0.1%明胶处理30min，接种2×104细胞进行细胞爬片，3～5d后进行组织化学染色。PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次×2min；0.1%Triton-X-100通透15min，PBS洗涤3次×2min；3%H2O2孵育15min灭活内源过氧化物酶；PBS洗涤后血清封闭1h，依次孵育RECQL一抗和相应二抗，并进行DAB显色和苏木素复染，最后用中性树胶封片。实验中均设已知阳性对照和PBS作为一抗的阴性对照。

1.2.4 镜检结果评定 2位病理医师分别在高倍显微镜（型号DM3000，德国Leica公司）下观察样本，根据染色强度和阳性细胞数评定RECQL的表达情况，综合后作出最终评定意见[13]。根据半定量计分法分别对染色强度和阳性细胞数进行计分。染色强度计分：无染色或轻度染色（1分，淡黄色）、中度染色（2分，棕黄色）、强染色（3分，黄褐色）；阳性细胞数计分：＜5%（1分）、5%～30%（2分）、31%～65%（3分）、＞65%(4分)。两项计分之和0分为阴性（-）、1～2分为弱阳性（+）、3～6分为阳性（++）、≥7分为强阳性（+++）。

1.2.5 细胞存活率和死亡率检测 转染siRNA后的细胞培养至24h或48h，收集上清液和细胞沉淀用PBS重悬，台盼蓝染色后用Countstar自动细胞计数仪（型号IC1000，上海睿钰公司生产）分析，直接读取细胞存活率，并计算细胞死亡率。

1.2.6 细胞周期检测 收集细胞，用预冷PBS洗涤后，加入预冷的70%乙醇，4℃固定过夜。离心取细胞沉淀，PBS洗涤，加入用PBS配置的含50μg/ml溴化乙锭（PI）染液4℃避光孵育30min，FACS上机检测G1、S、G2/M各期细胞比例。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 RECQL蛋白在不同HCC细胞中的表达情况 见图1。

由图1可见，Western blot法结果显示在BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761 4种细胞中均能检测到RECQL的表达，但SK-HEP-1中表达最强、BEL7404次之、Hep3B稍弱，SNU-761则表达量极弱（图1a）；免疫组化染色结果与Western blot法结果一致，SK-HEP-1评定为高表达（+++），SNU-761评定为低表达弱染色（+）（图1b）。根据以上结果，将BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B作为RECQL阳性表达组，SNU-761作为RECQL阴性表达组。

2.2 不同HCC细胞中转染RECQL-siRNA后RECQL mRNA表达水平及细胞存活率和死亡率比较 见图2、表1。

图1 RECQL蛋白在不同HCC细胞中的表达（A:Western blot法检测RECQL的表达；B:免疫组化法检测RECQL的表达，×100）

图2 不同HCC细胞转染siRNA后RECQL mRNA表达水平图（与空白对照组、阴性对照组比较，**P＜0.01）

由图2、表1可见，在4种HCC细胞中转染RECQL-siRNA 24h后，与空白对照组和阴性对照组相比，干扰组RECQL mRNA表达水平均明显降低（均P＜0.01）。在阳性表达组（BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B细胞）中干扰RECQL基因的表达，细胞存活率显著下降，细胞死亡率则明显升高（P＜0.05或0.01）；而在阴性表达组（SNU-761细胞）中，细胞存活率和死亡率均未见明显变化（均P＞0.05）。

2.3 SK-HEP-1细胞和THLE-2细胞转染siRNA后RECQL的蛋白表达水平及细胞存活率、死亡率比较见图3、表2～3。

表1 不同HCC细胞中转染RECQL-siRNA后细胞存活率和死亡率比较

图3 SK-HEP-1细胞和THLE-2细胞转染siRNA后RECQL的蛋白表达水平图（a：RECQL在两种细胞中的本底表达比较；b：转染siRNA后，RECQL在两种细胞中的表达情况）

由图3可见，正常肝细胞THLE-2中RECQL表达水平与阳性表达组细胞SK-HEP-1中相似（图3a）。通过转染5种不同序列的siRNA，均实现了不同程度的RECQL蛋白水平抑制表达（图3b）。

由表2、3可见，转染siRNA 48h后，HCC细胞SKHEP-1细胞存活率与空白对照组、阴性对照组比较均降低，细胞死亡率均升高（均P＜0.01）；而正常肝细胞THLE-2细胞存活率、死亡率与空白对照组、阴性对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 RECQL-siRNA对SK-HEP-1细胞中凋亡相关蛋白表达和周期分布的影响 见图4。

由图4可见，在RECQL阳性表达组细胞SK-HEP-中，凋亡相关蛋白PARP、cleaved-PARP和cleaved-caspase-3表达水平与空白对照组、阴性对照组相比变化不大（图4a）。干扰组与阴性对照组相比，G1、S期细胞比例变化不明显（P＞0.05），而G2/M期细胞比例明显上调（P＜0.05或0.01，图4b）。

表2 在SK-HEP-1和THLE-2细胞中干扰RECQL表达后细胞存活率比较（%）

表3 在SK-HEP-1和THLE-2细胞中干扰RECQL表达后细胞死亡率比较（%）

图4 RECQL-siRNA对SK-HEP-1细胞中凋亡相关蛋白表达和周期分布的影响（与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

RECQL是人类中第1个被发现的DNA解旋酶，作为RecQ家族中表达丰度最高的蛋白，与遗传性癌症易感综合征有关，通过DNA修复来维持基因组稳定性是它的主要功能。最新研究显示，RECQL有助于肿瘤的发生、发展，部分原因是其能通过调节下游基因的表达来促进癌细胞的迁移、侵袭和转移；RECQL的缺失会造成基因组不稳定、抑制癌细胞增殖[3,14]。

根据RECQL在4种HCC细胞中的蛋白表达情况，分为RECQL阳性表达组和阴性表达组。对RECQL-siRNA处理的细胞进行观察时，发现随着培养时间的延长，对照组细胞密度逐渐增加，而SK-HEP-1细胞转染siRNA后生长却受到严重影响，同样培养时间后细胞密度远远低于对照组；阳性组细胞（BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B）的细胞存活率均显著下降，细胞死亡率则明显上升，相反阴性组（SNU-761）的细胞存活率和死亡率都没有受到明显影响。这说明，RECQL-siRNA能够抑制HCC细胞的增殖生长，具有作为治疗HCC的靶向基因潜力，并且这种抑制作用可能依赖于RECQL的高表达。据研究，大多数HCC细胞具有不完整的DNA修复系统[15]，转染siRNA后，RECQL阳性HCC细胞和阴性HCC细胞在增殖上的差异，推测是因为这两类细胞的DNA修复、细胞周期等相关通路不同：阳性组细胞相关通路为RECQL依赖性，且极有可能是通过高表达RECQL此修复酶和DNA复制的良好协调来修复DNA损伤，从而保证细胞周期的正常进行，而阴性组细胞则为RECQL非依赖性。因此，在RECQL沉默后，阳性组的细胞增殖因通路受阻而被抑制，阴性组则不受影响。

目前大多数化疗药物在治疗中不仅杀死癌细胞，也会对正常组织造成不利影响，只有找到只杀伤癌细胞、对正常细胞无影响的靶向基因，才能起到更好的治疗作用。那么RECQL-siRNA的增殖抑制作用是只针对RECQL高表达的HCC细胞，还是对正常肝细胞也会产生影响？为了阐明RECQL-siRNA对正常肝细胞是否具有杀伤作用，笔者同步检测RECQL-siRNA对HCC细胞和正常肝细胞的作用，结果显示在RECQL阳性HCC细胞中，RECQ1-siRNA能够降低细胞存活率、增加细胞死亡率，而其对正常肝细胞THLE-2的细胞存活率和死亡率均无影响，这说明RECQL沉默表达对细胞增殖的抑制作用只对RECQL高表达的HCC细胞有效，而对正常肝细胞是没有抑制作用的。Thangavel[16]曾报道RECQL在DNA复制起点位置累积，RECQL的瞬时缺失会降低复制开始的概率，并进一步导致复制起始处DNA序列的减少，如果大多数复制起点失活，大量DNA只能通过极少的DNA聚合酶复合体，这会形成更大的染色体环；Popuri等[17]发现RECQL稳定缺失可以影响细胞增殖并使细胞对各种DNA损伤应激的灵敏度增强，直接或间接阻断DNA复制叉的形成，此外，还会导致未凝集染色体缺陷累积，暗示RECQL缺失细胞DNA复制后进入分裂期可能较慢，这也很好地解释了RECQL沉默表达可以诱导有丝分裂障碍并杀伤癌细胞的报道[15]。本研究中正常肝细胞耐受RECQL沉默表达，未引起增殖抑制，推测可能是正常细胞能够自动修复RECQL沉默造成的DNA损伤，从而保证细胞周期的正常进行。Furuichi等[15]对DNA修复和周期相关蛋白（TP53,Rb1, p16/INK4a和p21/WAF1）检测发现其在不同的细胞系中表达差异较大，特别是p21/WAF1基因，其在很多HCC细胞中表达极低甚至不表达，而正常细胞中表达量较高，可能正是周期检查点相关蛋白缺陷，使HCC细胞不能自动修复DNA损伤造成的有丝分裂障碍，最终导致细胞增殖受到影响。

既然转染RECQL-siRNA后，SK-HEP-1细胞的增殖受到抑制，那么与细胞增殖生长密切相关的凋亡和周期是否受到影响呢？RECQL沉默表达后，凋亡相关蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase-3等表达水平不受太大影响。但Matsushita[11]在上皮性卵巢癌中沉默RECQL表达，引起细胞凋亡；另外，在经RECQL-siRNA处理的HCC细胞和卵巢癌细胞中，发现代表碎片的subG1峰表达很高[11,15]。与之结果不同的是本研究检测到RECQL-siRNA处理组的G2/M期细胞比例有所升高，而在早期Futami的研究中，RECQL-siRNA增加癌细胞有丝分裂死亡，并被阻滞于M期[18]。据报道，如果转染siRNA后，癌细胞仍表达高水平DNA修复酶RECQL，那么DNA异常细胞就仍然可以进入M期，发生M期阻滞[11]。所以可能是受RECQL-siRNA表达效果、转染效率、检测时间等因素影响，没有直接诱发细胞凋亡，而是经历不均匀分裂后停止于M期，诱导有丝分裂灾难或者细胞异常分裂。

综上所述，在体外RECQL-siRNA可以抑制RECQL高表达的HCC细胞增殖生长，引起细胞存活率的降低和死亡率的升高，并对正常肝细胞没有影响，是一种针对肝癌的潜在分子靶标药物；RECQL沉默表达不诱导HCC细胞凋亡，但引起有丝分裂障碍，使细胞周期阻滞于G2/M期。除了HCC，对于其它类型的肝癌RECQL-siRNA是否具有同样的增殖抑制作用、RECQL-siRNA临床上的抑癌作用是否也依赖于RECQL的高表达都值得深入研究。今后，将通过体内实验，深入研究RECQL对肝癌发生、发展的作用机制，并探讨RECQL-siRNA作为肝癌治疗药物的可行性，还将进行临床前瞻性研究，进一步验证RECQL作为预测肝癌恶性和进展生物标志物的潜力。

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RECQL-siRNA inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines in vitro

Objective To investigate the effect of RECQL on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell lines in vitro．MethodsHepatocellular carcinoma (HCC)BEL7404,SK-HEP-1,Hep3B and SNU-761 cells were transfected with RECQL-siRNA in vitro to silence RECQL．The expression of RECQL protein was detected with Western blot and immunohistochemistry．The viability of HCC and normal liver THLE-2 cells were examined,the expressions of apoptosis-related proteins were detected with Western blot and cell cycle distribution was observed using FACS．Results RECQL protein was positive in BEL7404,SK-HEP-1 and Hep3B cells,and negative in SNU-761 cells．RECQL-siRNA inhibited the proliferation of HCC cells significantly in the RECQL-positive expression HCC cells(P＜0．05),but had no effect on HCC SNU-761 cells and normal liver THLE-2 cells．In SK-HEP-1 cells transfected with RECQL-siRNA,the expression of cleaved caspase-3 and cleaved PARP had no significant change,but the ratio of G2/M phase cells was significantly increased(P＜0．05 or 0．01)．Conclusion RECQL-siRNA can inhibit the proliferation of HCC cells with positive RECQL,indicating that RECQL may be a potential target gene for treatment of liver cancer．

RECQL Human hepatocellular carcinoma Cell apoptosis Cell cycle

2016-11-03）

（本文编辑：马雯娜）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2016-1804

国家自然科学基金项目（81602671）；浙江省自然科学基金项目（LQ17H160003）

310006 杭州，南京医科大学附属杭州医院、杭州市第一人民医院转化医学研究中心

张仕蓉，E-mail:shirley4444@gmail.com