Xpert MTB/RIF技术在早期诊断耐药结核中的应用研究

何 坤，夏 勇，袁国丹

(重庆市公共卫生医疗救治中心 400000)

·经验交流·

Xpert MTB/RIF技术在早期诊断耐药结核中的应用研究

何 坤，夏 勇△，袁国丹

(重庆市公共卫生医疗救治中心 400000)

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)技术早期判断耐药结核的临床应用价值。方法收集本中心462例确诊为结核病患者的痰样本，分别进行Xpert MTB/RIF技术检测、结核罗氏培养+药敏试验检测。结果Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药率为22.6%(95/420)，快速药敏检测利福平耐药率为19.8%(83/420)，比较差异有统计学意义(P<0.05)；两种方法检测对利福平均耐药者为78株，平均敏感者为320株，两种方法结果一致率为94.8%(398/420)。Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的结果敏感度93.97%，特异度94.96%。对结果进行Kappa一致性检验，Kappa=0.843，一致性较好，阳性预测值82.11%，阴性预测值98.46%。结论Xpert MTB/RIF检查可快速、准确判断对利福平耐药的结核。

Xpert MTB/RIF；利福平；肺结核；结核罗氏培养；药敏试验

结核病是一种危害人类健康的传染性疾病，我国为结核高发国家之一。据WHO监测统计，新的结核病患者中，有10.2%的患者会出现对至少一种抗结核药物耐药。我国每年新增耐多药结核(MDR-TB)患者约12万人，其传染性更强、治愈率更低，病死率可达1/4，因此如何更好地发现结核病患者，尤其是MDR-TB患者，是控制耐药结核传播的关键[1]。在抗结核治疗时了解患者否对利福平耐药至关重要，其可作为MDR-TB判断标准[2-3]。国外已有文献报道了Xpert MTB/RIF技术在肺结核诊断中的准确性[4-5]。本研究收集本中心462例确诊为结核病患者的痰标本进行Xpert MTB/RIF技术与结核培养、药敏试验检测，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1-12月于本中心就诊的初次确诊为结核病且既往从未服用过任何抗结核药物的患者462例，其中男277例，女185例，年龄15～75岁。患者均已签订知情同意书。

1.2方法

1.2.1试剂 Xpert MTB/RIF反应盒及样品试剂(SR)均购自美国Cepheid公司；结核罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2.2检测方法 对所有确诊结核患者的痰标本进行Xpert MTB/RIF技术检测、结核罗氏培养+药敏试验检测。按照结核病诊断实验室检验流程进行操作[6]。

1.2.2.1Xpert MTB/RIF核酸扩增检测 取1 mL痰标本放至有螺旋盖的前处理管中，然后加入2倍痰标本体积的SR痰标本处理液，旋紧前处理管，在涡旋振荡器上振荡15～30 s，室温静置15 min，使痰标本充分液化。打开反应盒，取2 mL处理后的样品由加样孔缓慢加入反应盒，然后将反应盒放置到检测模块，仪器开始进行自动化检测。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。

1.2.2.2结核罗氏培养 吸取2.0 mL痰标本至带螺旋盖的前处理管中，视样本性状，加入1～2倍体积4%氢氧化钠前处理液，置涡旋振荡器上振荡30～60 s，至标本充分混匀，室温放置15 min。前处理完成后，以无菌吸管吸取前处理液0.1 mL，均匀接种在2支中性罗氏培养基斜面上，保持斜面水平向上37 ℃培养24 h 后，直立放置37 ℃ 继续培养。接种后第3、7天观察培养情况，此后每周观察1 次，并在分离培养结果记录本上记录生长结果

1.2.2.3结核快速药敏试验 用接种环取1 环培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对制成1 mg/mL 菌悬液，梯度稀释为10-1mg/mL，接种0.01 mL到对硝基苯甲酸(PNB) 和噻吩-2-羧酸肼(TCH) 培养基，同时梯度稀释10-2mg/mL 和10-4mg/mL，接种0．01 mL 到含利福平(40.0 μg/mL)和异烟肼(0.2 μg/mL)的罗氏固体培养基和空白对照管培养基，37 ℃培养4 周，观察结果。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，计数资料用率表示，组间采用χ2检验、校正χ2检验和确切概率法，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。对Xpert MTB/RIF技术检测和结核快速药敏进行一致性kappa检验，≥0.75认为一致性较好。

2 结 果

2.1基本情况 462例确诊结核的患者痰标本全部进行Xpert MTB/RIF技术检测、结核罗氏培养+药敏试验。Xpert MTB/RIF技术检测结果为阳性460例(99.6%)，阴性2例(0.4%)；结核罗氏培养检测结果为阳性420例(90.9%)，因此本研究中以420例样本进行分析。

2.2药敏试验检测结果 以结核快速药敏试验结果为金标准，经Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药率22.6%(95/420)，快速药敏检测利福平耐药率19.8%(83/420)，两种方法检测对利福平均耐药者为78株，平均敏感者为320株，两种方法结果一致率为94.8%(398/420)，耐药率比较差异有统计学意义(P<0.05)。Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的结果敏感度93.97%，特异度94.96%。对结果进行Kappa一致性检验，Kappa=0.843，数值大于0.75表明一致性较好，阳性预测值82.11%，阴性预测值98.46%。

2.3异烟肼与利福平交叉耐药对比 以结核快速药敏试验结果为金标准，本研究中利福平耐药共83株，其中同时对异烟肼耐药有73株，利福平、异烟肼同时耐药比例为88%。

3 讨 论

结核病和结核病耐药性的准确、快速检测对提高患者预后和降低结核病的传播至关重要。传统的抗酸染色涂片被广泛应用于结核快速诊断，但其灵敏度低，容易漏诊，且无法区分非结核分枝杆菌(NTM)。结核培养及药敏试验作为金标准，固体培养需要4至6周，在结核培养基础上进行药敏检测，需要2至4周，总计大概需要3个月，无法满足临床诊疗需求。因此，需要一种快速、简便、准确的检测方法用于临床诊断及指导治疗。

目前，分子生物学发展迅猛，有多种方法检测结核耐药性。其中有3个试验方法检测临床标本中结核菌株是否耐药，结果较为理想。Geno Type MTB DRplus(海恩基础生物，德国)主要检测rpoB、KatG基因是否突变，从而判断是否对利福平、异烟肼耐药。INNO-LIPA Rif TB试剂盒(Fujirebio，比利时)检测靶向DNA基因rpoB突变情况。Xpert MTB/RIF(Cepheid 美国)检测技术，整合传统PCR检测的3个步骤，自动化将标本提供到试剂盒，进行核酸的提取、扩增、目标序列检测。采用半巢式实时荧光定量PCR技术，主要是检测结核分枝杆菌及利福平耐药基因rpoB的81 bp是否突变，明确是否耐药[7-8]。其中，Xpert MTB/RIF检测技术在所有分子生物检测手段中是最具成本效益的[9-10]。WHO建议Xpert MTB/RIF技术作为结核病初期诊断测试，特别适用于怀疑合并感染HIV的患者[11-12]，避免延误病情。

在本研究中，结核快速药敏检测方法作为金标准，Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药性与结核快速药敏法具有较高一致性。Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药敏感度93.97%，特异度94.96%。对结果进行Kappa一致性检验，Kappa=0.843。同时，对利福平及异烟肼交叉耐药情况进行数据对比分析，研究结果显示两种药物同时耐药率达89.00%。本研究中结果与国内外报道结果基本一致[13-14]。

因此，Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌利福平耐药的结果具有较好可靠性，可以早期准确判断出是否为耐多药结核菌株。此外，在本研究中，有23例Xpert MTB/RIF技术检测结果与结核快速药敏不一致。原因考虑：(1)结核分枝杆菌基因表型与体外表型结果不一致，已有文献进行报道。(2)利福平rpob基因511、533位点突变，影响检测结果。(3)混合有非结核分枝杆菌感染[15]。在今后临床工作中，可随访患者治疗方案及预后，整理实验室结果与临床治疗效果对比分析。

综上所述，Xpert MTB/RIF技术操作简单、快捷方便，可提供准确的诊断结果，尤其适用于对可疑耐药结核、合并HIV感染的患者。同时，可以让MDR-TB治疗快速启动，以待常规结核培养和药敏结果。

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1671-8348(2017)26-3707-02

2017-02-26

2017-06-14)

何坤(1984-)，主治医师，硕士，主要从事结核方面研究。△

，E-mail:xiayong_7777@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.039