槟榔黄化病病原及检测方法研究进展

车海彦++曹学仁++罗大全

摘 要 黄化病是一种严重威胁槟榔生产种植的毁灭性传染性病害，目前主要在印度和我国槟榔主产区发生。本文从非生物与生物因素两方面对槟榔黄化病病原认识过程及检测方法进行详细的综述。

关键词 槟榔黄化病 ；病原 ；检测方法

中图分类号 S432.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.016

Research Advances in Pathogenic Detection Technique for

Arecanut Yellow Leaf Disease

CHE Haiyan CAO Xueren LUO Daquan

（Environment and Plant Protection Institute CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory

of Integrated Pest Management on Tropical Crops / Hainan Key Laboratory for Monitoring

and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101）

Abstract Arecanut yellow leaf disease is a lethal infectious malady which seriously hampers arecanut production. It occurs mainly in arecanut plantations in India and China. The recognition and detection of the pathogen of the arecanut yellow lead disease were reviewed from the abiotic and biotic aspects.

Keywords arecanut yellow leaf disease ； pathogen ； detection methods

槟榔（Areca catechu L.）为棕榈科多年生常绿乔木，其果实主要作为咀嚼嗜好品，并具有药用价值。主要种植在亚洲，如印度、印度尼西亚、中国、泰国、马来西亚、越南、缅甸、柬埔寨等国家，我国槟榔主要种植在海南和台湾[1]，据海南省农业厅统计，截止2013年，海南种植面积已达90 886 hm2，占全国的95%以上，是海南省第二大热带经济作物。

槟榔黄化病（Arecanut yellow leaf disease，AYLD）是一种严重危害槟榔生产种植的毁灭传染性病害。1914年，人们首次在印度的Kerala发现AYLD，目前该病害仅在印度、中国和斯里兰卡等3个国家有报道发生[2-4]。本文从非生物与生物因素两方面对槟榔黄化病病原认识过程及检测方法等进行了综述。

1 非生物因素

槟榔黄化病在印度发生后，人们怀疑该病害可能是一种生理性病害，对槟榔叶片和土壤中的大量和微量元素、水分等进行研究，发现上述指标部分发生变化，但均不能证实上述因素是引起黄化病发生的病因[5-9]。1985年3～4月份，俞浩等通过对我国海南万宁、屯昌等地发生黄化的槟榔园调查分析认为，黄化病是由缺钾引起的生理性病害，但位于屯昌的海南省药材场部分槟榔园追施钾肥及部分微量元素后未见症状减轻，到2001年时，该场槟榔黄化病发生面积已有由1981年的6.67 hm2擴展到23.3 hm2以上[10-11]。

2 生物因素

2.1 螨虫

Khandige等[12]首次在感染黄化病的病叶中发现螨虫，认为螨虫与黄化病发生相关。Menon等[13]研究表明由螨虫引起的黄叶可以通过喷施对硫磷消除症状，证明螨虫不是黄化病病原。

2.2 真菌

Menon[14]和Anonymous[15-16]先后从感病槟榔的不同部位分离出色二孢（Diplodia sp.）、尾孢（Cercospora）、镰刀菌（Fusarium sp.）、木霉（Trichoderma sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、盘多毛孢菌（Pestalotia sp.）等多个属的真菌，但将它们回接到幼苗上均不能引起黄化病。Rawther[17]发现感病的植株根部大多腐烂，推测该病害由真菌引起。此后研究发现，根腐与黄化病没有关系，健康与感病叶片上的真菌种类也未见显著差异，说明黄化病与真菌无关[18-19]。

2.3 细菌

1962～1964年，印度科研人员从病树的根部分离到Bacillus，Xanthomonas和Serratia细菌，但接种槟榔苗上，未表现黄化病症状[20-21]。Srivastava等[22]观察到感病槟榔根部存在细菌菌流，认为与黄化病相关，并从中分离出2个菌株，其中1个被鉴定为假单孢菌。人们对槟榔园中的细菌进行研究发现，感病的槟榔园中细菌数量远多于健康的槟榔园，来自印度Palode地区大约70%感病的槟榔样品根部发现细菌菌流，来自Mohitnagar地区的大约20%健康样品根部发现细菌菌流，但是来源于Vittal地区的健康样品根部没有发现细菌菌流[23-24]。尽管人们对细菌与黄化病发生的关系做了大量研究，但未见关于用柯赫氏法则验证细菌与黄化病发生关系的文献报道。

2.4 线虫

Nair[25]在印度Kerala地区感染黄化病的槟榔根区发现爪哇根结线虫（Meloidogyne javanica），螺旋属线虫（Helicotylenchus）和矮化属线虫（Tylenchorhynchus），首次提出线虫与黄化病的关系。随后科研人员从健康和感病槟榔园中分离到螺旋属线虫（Helicotylenchus）、真滑刃线虫属（Aphelenchus）等多个属的线虫[26-28]。1974年到1979年间，印度的Central Plantation Crops Research Institute对Kerala，Karnataka和Tamil Nadu地区的槟榔园中的线虫种类和数量等做了大量的调查研究工作，从435份土壤样品和822份根部样品中分离到28个属的植物寄生线虫，其中肾线虫（Rotylenchulus reniformis）、香蕉穿孔线虫（Radopholus simillis）、双宫螺旋线虫（Helicotylenchus dihystera）、芒果拟鞘线虫（Hemicriconemoides mangiferae）、塞氏纽带线虫（Hoplolaimus seinhorsti）在土壤样品中数量最多。香蕉穿孔线虫（Radopholus simillis）在根部样品中数量最多，病根每克根最多产生440个线虫，而健康根每克最多产生48个线虫[29-31]。Sundararaju[32]用杀线虫剂处理槟榔园后，黄化病的发生率降低，产量提高。Koshy等[33]将感病槟榔根部分离的香蕉穿孔线虫接种到健康槟榔苗上，经过2年观察发现，与对照相比，接种的幼苗叶片变为橙色，根部坏死，植株长势差、高度低、树冠变小，叶片数量少。再将从感病幼苗根部分离的香蕉穿孔线虫回接到健康槟榔树上，经过3年的观察发现，与对照相比，接种树的根变短、根重变低、叶片数量变少、树冠变小等。 接种幼苗和大树虽然表现感病症状，但未出现槟榔黄化病的田间典型表现症状。

2.5 病毒

Menon[34-36]通过纸层析的方法在感病叶片汁液中发现具有活性的核蛋白，将免疫获得的兔血清与感病槟榔叶片粗提纯液进行免疫反应，有沉淀产生，该病害能通过汁液或土壤传播到槟榔和指示植物豇豆（Vigna unguiculata）、洋刀豆（Canavalia ensiformis D C.）等上，推测病毒或类病毒可能是引起该病害的病原。Nayar[37]通过组织病理学研究发现，槟榔感病后组织学上发生的变化与病毒侵染后引起的变化相似。

2.6 植原体

2.6.1 植原体病原认识过程

植原体（Phytoplasma）原称类菌原体（Mycoplasma-like organisms， MLOs），无细胞壁，由生物膜包围，隶属于细菌界（Bacteria）。1971年，Nayar[38]从感病槟榔植物叶组织培養到疑似植原体的生物，首次提出植原体与黄化病相关。1978年，Nayar 和 Seliskar[39]通过电子显微镜首次在感病槟榔的筛管组织中发现植原体。随后其他研究者也在感病槟榔植株多个器官的筛管组织中观察到植原体，含量由高到低依次为顶端分生组织、根尖、叶轴、叶柄、心叶，成熟的老叶中含量较低[40-42]。利用Dienes和DAPI等染色剂，通过光学显微镜观察，也进一步证实了感病植株筛管组织中存在植原体[43]。Nair & Daniel[44]发现感病的槟榔园中存在与植原体病害传播相关的甘蔗斑袖蜡蝉（Proutista moesta）。Ponnamma等[45-47]将田间捕获的甘蔗斑袖蜡蝉在感病植株上获毒饲育后，再将其投放到健康植株上，在甘蔗斑袖蜡蝉的唾液腺中观察到植原体。从1987年5月到1990年10月，通过持续的实验研究，发现6株经树蝉传毒的槟榔均表现叶片黄化症状，其中在5株中观察到植原体存在，空白对照样品中均未发现植原体。随着分子生物学技术的发展，采用巢式或半巢式PCR技术，Manimekalai[48-49]从印度的Karnataka的Sullia地区采集发病样品，提取了感病植株花序、根部和叶片样品的DNA，克隆了16S rDNA和 secA 基因，通过序列分析确定印度槟榔黄化植原体病原归属于‘Candidatus Phytoplasma oryzae-related strain（16SrXI组）。Muddumadiah等[50]也从上述地区采集样品，扩增得到的 16S rDNA序列，经克隆测序分析发现该植原体属于‘Candidatus Phytoplasma asteris （16SrI组）。

我国自1981年在海南屯昌首次发现黄化病以来，科研人员对病原开展了一系列的研究工作。金开璇等[11]通过电镜观察，在槟榔黄化病病株中发现类细菌和类菌原体。罗大全等[51-53]通过电镜在感病槟榔筛管组织中观察到植原体，未发现类细菌，经四环素注射可以抑制病情发展，这与植原体对四环素族抗菌素反应是一致的，利用植原体通用引物对，在表现黄化症状的样品中通过PCR技术扩增到植原体特异条带，进一步证实植原体是引起黄化病的病原，但是用椰子致死性黄化病病原特异性扩增引物对在槟榔黄化样品中扩增不到特异片段。车海彦等[54]通过对采集自屯昌、琼海、定安、万宁、三亚等5个市县的15个感病植株的花苞进行PCR检测，在15个样品的花苞DNA中均扩增到植原体16S rDNA，通过分析确定该植原体病原属于16SrI-G亚组组。周亚奎等[55]采集海南3个市县28个感病样品，在9个叶片样品中检测到植原体，经PCR检测克隆测序分析，该植原体属于16SrI-B亚组。未有研究证实海南槟榔黄化病样品中存在上述两种植原体的复合侵染。杨文君等[56]克隆了海南琼海的槟榔黄化植原体膜蛋白基因（AcPmp）编码区，构建原核表达载体，并制备了效价高、特异性强的抗血清。唐庆华等[57]在对海南槟榔园中传毒昆虫调查中发现印度报道的甘蔗斑袖蜡蝉，该虫在槟榔园中属常见昆虫，但未确定其是否为海南槟榔黄化病的传毒昆虫。刘慧娟[58]利用RAPD扩增体系，将海南槟榔分为两种类型。两种类型均有非病区样品分布，但是两种类型中的槟榔群体，在发病时间和发病程度上存在一定的差异。第一类型槟榔群体发病较重、较早；第二类型中非病区槟榔群体较多。科研人员还对槟榔树感染黄化病后，体内发生的变化进行了研究，槟榔感病后，Cu含量升高，叶片中Ca、Mg 、Zn、B、Mo、Fe、Mn含量降低[59-60]，植株中相关酶活性、蛋白含量、激素含量等也发生了变化[61]。植株中核酮糖1，5-二磷酸羧化/加氧酶和蕈状支原体高同源蛋白，可能参与了槟榔黄化病发生和发展过程[62]。

2012年，人们在斯里兰卡南部的槟榔树上发现黄化病，Kanatiwela-de Silva等在斯里兰卡的马特勒（Matara）地区采集疑似感染黄化病的槟榔叶片样品，通过扫描电子显微镜，在感病槟榔叶片筛管组织的内表面观察到直径在100～1 000 nm的植原体，进一步通过巢式PCR扩增植原体secA基因，经克隆测序分析发现该植原体属于16SrXIV组[4]。

2.6.2 植原体病原检测技术

槟榔黄化病田间主要根据其症状表现进行识别：发病初期，植株下部倒数第2～4张羽状叶片外缘1/4处开始出现黄化，然后逐渐向叶中扩展，黄化部分与绿色部分有明显的分界，新抽生的叶片短小，无法正常舒展长大，节间变短，抽生的花穗短小。

随着科技水平的提高，人们开始使用血清学方法对槟榔黄化植原体病原进行检测，2011年，Rajeev等[63]将从感病槟榔中纯化的植原体，免疫兔子，获得多克隆抗体，经琼脂双扩散和抗原直接包被法检测证明，制备的抗体可以区分健康和感病植株。

常规PCR经常检测不到槟榔黄化植原体病原，科研工作者大多使用巢式、半巢式和实时荧光PCR对病原进行检测，车海彦等[54]、周亚奎等[55]利用植原体通用引物R16mF2/R16mR1和 R16F2/R16R2对海南槟榔黄化植原体病原进行检测，扩增到大小约1 200 bp的特异条带。Manimekalai等[49-50]利用植原体通用引物P1/P7-R16F2n/R16R2、根据椰子根萎蔫植原体设计的引物1F7/7R3-1F7/7R2和4Fwd/3Rev-4Fwd/5Rev对印度槟榔黄化植原体病原进行检测，分别扩增到大小约为1 200 bp、500 bp和1 100 bp的特异条带。Kanatiwela-de Silva等[4]利用引物SecAfor1/SecArev3（植原体通用引物）和RicesecAfor2/RiceseAcrev3（植原体16SrXI与16SrXIV组特异引物），对斯里兰卡槟榔黄化植原体病原进行巢式PCR检测，扩增到大小为420 bp的特异条带。车海彦等[64]基于海南槟榔黄化植原体（16SrI组）16S rRNA基因设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针组合，建立了海南槟榔黄化植原体的实时荧光PCR快速检测方法。Nair等[65-66]基于印度槟榔黄化植原体（16SrXI组）16S rRNA基因建立起适合检测槟榔黄化植原体的SYBR green法建立实时荧光PCR检测体系和LAMP技术体系。上述方法简单、快速，适合病害的田间快速诊断、种苗繁育过程中进行快速检测。

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① 基金项目：农业科技成果转化资金项目（No.2014GB2E200114）；海南省重大科技计划项目（No.ZDZX2013019）。

收稿日期：2016-09-18；责任编辑/郑淑娟；编辑部E-mail： rdnk@163.com。

② 车海彦（1976～），女，博士，副研究員，研究方向为植物病毒与植原体病害，E-mail：chehaiyan2012@126.com

③ 通讯作者：罗大全（1968～），男，研究员，研究方向为植物保护，E-mail：luodaquan@163.com。