瓠瓜类型砧木遗传作图群体双亲多态性分析

宋慧+王毓洪+张香琴

摘要：以耐湿涝瓠瓜类型砧木材料JZS与不耐湿涝材料T2002为遗传作图双亲，利用随机扩增多态性DNA（random amplification polymorphic DNA，简称RAPD）法与瓠瓜及其他近源瓜类简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）进行多态性分析。从供试1 678个RAPD、SSR标记中共筛选到26个多态性引物，其中包括14个RAPD、4个瓠瓜SSR、2个甜瓜SSR、5个黄瓜SSR、1个南瓜SSR，扩增出28个多态性位点。几种标记多态性检测效率不同，瓠瓜SSR引物揭示，双亲多态性比例最高（0.47%），其次是RAPD（0.38%），近源瓜类SSR选择效率最低，仅有0.14%～0.15%。结果表明，尽管瓠瓜作图亲本表型差异大，但分子标记结果显示亲本遗传背景相近；甜瓜、黄瓜和南瓜与瓠瓜亲缘关系远，具有种属特异性的SSR引物在瓠瓜亲本JZS、T2002多态性分析中通用性不高。为了提高分子标记多态性分析效率，绘制高密度遗传图谱，下一步应尽快开展基于基因组测序技术检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP）位点的研究。

关键词：瓠瓜；砧木；多态性分析；耐湿涝

中图分类号： S184 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0048-03

我国约有2/3的国土面积存在不同程度的湿涝胁迫，严重影响黄瓜、西瓜和甜瓜等瓜类作物种植生产[1]。瓠瓜[Lagenaria siceraria （Molina） Standl.]根部发达，用作瓜类嫁接砧木，能够增强接穗耐逆性，提高产量[2]。耐湿涝瓠瓜砧木的选育已成为瓠瓜育种的重要目标之一。

瓠瓜耐湿涝特性是由多基因控制的数量遗传性状[3]。前期笔者通过集团混合分离分析法（bulked segregation analysis，简称BSA），以不定根数作为鉴定指标，筛选到简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）引物S87/88与瓠瓜耐湿涝性状相关性为0.78，这与瓠瓜耐湿涝特性目的基因尚存在较大遗传距离[4]，影响分子辅助选择的正确性，亟须通过遗传图谱构建和耐湿涝数量性状基因座（quantitative trait locus，简称QTL）定位等手段为瓠瓜耐湿涝分子育种提供紧密连锁分子标记。

SSR引物具有种属特异性，瓠瓜基因组研究相对于黄瓜、西瓜和甜瓜等瓜类作物相对薄弱，仅有浙江省农业科学院李国景研究员所在课题组的相关报道[5]，瓠瓜SSR开发数目有限。为此，笔者所在课题组利用随机扩增多态性DNA（random amplification polymorphic DNA，简称RAPD）、瓠瓜SSR及其他近源瓜类SSR，对瓠瓜类型砧木遗传作图双亲（耐湿涝材料JZS与不耐湿涝材料T2002）进行多态性分子标记分析，以期为瓠瓜遗传图谱构建和耐湿涝QTL定位研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用材料为瓠瓜类型砧木耐湿涝材料JZS、不耐湿涝材料T2002及其F1代。将种子播种于32孔穴盘中，按常规方法进行田间管理。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 材料播种后，待植株长至5～6张真叶时，每份样品各取10张单株的混合叶片，每株采集1 g嫩叶，于-80 ℃保存。參照CTAB法，提取新鲜叶片总基因组DNA。

1.2.2 分子标记分析 甜瓜SSR引物序列由美国威斯康星大学园艺系翁益群教授提供，瓠瓜SSR引物序列由浙江省农业科学院蔬菜研究所李国景研究员提供。RAPD、SSR的混样体系为20μL，包括3.24 μL dNTP（1.25 mmol/L）、1.5 μL 10×buffer、2.43 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.35 μL引物（5 mmol/L）、5 μL DNA（10 ng/μL）、0.05 μL Taq DNA聚合酶（1 U）。RAPD、SSR的PCR产物分别用2%琼脂糖凝胶和高分辨率MS-6琼脂糖凝胶（TaKaRa，上海）水平电泳检测。

1.3 数据记录与连锁分析

根据相同迁移率位置表现出的差异带型，确定在双亲中显示差异的分子标记，用于多态性分析。

2 结果与分析

2.1 RAPD引物在双亲中的扩增和多态性筛选

600对RAPD引物分别在双亲JZS、T2002中扩增出4 188、4 197个条带，平均每个引物产生6.99个条带（表1）。筛选到14个RAPD引物（分别编号为P21、P38、P77、P79、P80、P86、P184、P214、P237、P284、P289、P366、P421、P589），共扩增出16个多态性位点（图1）。RAPD引物揭示双亲的多态性比例为0.38%。

2.2 瓠瓜SSR在双亲中的扩增和多态性筛选

100对瓠瓜SSR引物分别在双亲JZS、T2002中扩增出852、854个条带，平均每个引物产生8.53个条带（表1）。筛选到4对引物（分别为S35/36、S45/46、S49/50、S87/88），共扩增出4个多态性位点（图2）。瓠瓜SSR引物扩增结果显示，亲本材料的多态性比例为0.47%，高于RAPD揭示的多态性比例（0.38%）。

2.3 甜瓜SSR、黄瓜SSR和南瓜SSR在双亲中的扩增和多态性筛选

分别使用251对甜瓜SSR、595对黄瓜SSR和132对南瓜SSR对双亲JZS、T2002进行扩增，结果筛选到2对甜瓜SSR（T35/36、T193/194）、5对黄瓜SSR（H37/38、H41/42、H49/50、H61/62、H241/242）和1对南瓜SSR（N15/16）（图3），3种SSR引物揭示双亲多态性比例分别为0.14%、0.15%、0.14%，低于RAPD引物（0.38%）、瓠瓜SSR（0.47%）揭示的多态性比例。

3 讨论

作物耐湿涝特性是较为复杂的数量性状，国内外有关耐湿涝的研究多集中在小麦[6]、大麦[7]、玉米[8]等大田经济作物，葫芦科作物中除了模式作物黄瓜有少量报道[9]以外，鲜有报道提及其他瓜类作物的耐湿涝研究。瓠瓜根系发达，耐湿涝特性突出，是瓜类作物耐湿涝性状改良的重要基因库。尽管众多葫芦科作物很早就被用来开展利用分子遗传图谱定位重要农艺性状的研究[10-11]，但是针对瓠瓜耐湿涝特性QTL定位的研究未见开展，从而制约了进一步利用分子手段改良瓜类作物耐湿涝特性的研究进程。

瓠瓜表型變异大，但从分子标记研究结果来看，瓠瓜遗传背景狭窄。在本研究中，几种标记多态性检测效率不同，瓠瓜SSR、RAPD揭示耐湿涝亲本JZS和不耐湿涝亲本T2002的多态性比例分别只有0.47%、0.38%，而选用的近源瓜类SSR选择效率更低，多态性比例仅为0.14%～0.15%，一方面表明作图亲本JZS和T2002亲缘关系近，另一方面表明甜瓜、黄瓜、南瓜与瓠瓜亲缘关系远，基于种属特异性的SSR引物在JZS、T2002多态性分析中通用性不高。

Neuhausen认为，葫芦科作物的基因组变化主要源于点突变[12]，因此RAPD、SSR这类基于扩增片段多态性的分子标记能够检测的多态性较低，有必要进一步开展基于测序技术检测单核苷酸多态性位点（SNP）的多态性研究，提高分子标记分辨率，为绘制高密度遗传图谱奠定良好基础。

参考文献：

[1]陈嵘峰. 黄瓜品种资源的耐涝性鉴定及耐涝相关性状QTL的初步定位[D]. 扬州：扬州大学，2009：15-19.

[2]Davis A R，Perkins-Veazie P，Sakata Y，et al. Cucurbit grafting[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2008，27（1）：50-74.

[3]张艳欣，王林海，黎冬华，等. 芝麻耐湿性QTL定位及优异耐湿基因资源挖掘[J]. 中国农业科学，2014，47（3）：422-430.

[4]宋 慧，张香琴，高 旭，等. 瓠瓜耐湿涝相关根系性状遗传规律及分子标记筛选[J]. 华北农学报，2013，28（4）：62-65.

[5]Xu P，Wu X H，Luo J，et al. Partial sequencing of the bottle gourd genome reveals markers useful for phylogenetic analysis and breeding[J]. BMC Genomics，2011，12（1）：467-477.

[6]Yu M，Chen G Y. Conditional QTL mapping for waterlogging tolerance in two RILs populations of wheat[J]. Springer Plus，2013，2（1）：245.

[7]栾海业. 大麦苗期耐湿性遗传分析与QTL定位[D]. 扬州：扬州大学，2011：25-28.

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[9]Yeboah M A，Chen X，Feng C R，et al. Genetic component analysis of waterlogging tolerance in cucumber[J]. Indian Journal of Horticulture，2008，65（3）：280-284.

[10]范 敏，许 勇，张海英，等. 西瓜果实性状QTL定位及其遗传效应分析[J]. 遗传学报，2000，27（10）：902-910.

[11]羊杏平，刘 广，侯喜林，等. 利用RAPD和ISSR分子标记对西瓜作图亲本的多态性分析[J]. 江苏农业学报，2009，25（5）：1100-1107.

[12]Neuhausen S L. Evaluation of restriction fragment length polymorphism in Cucumis melo[J]. Theoretical and Applied Genetics，1992，83（3）：379-384.