兔粪中产纤维素酶菌的分离 筛选与初步鉴定

董小英 ，詹沛运 ，任晓强 ，胡鸿惠 ，唐胜球 *

（1.韶关学院英东农业科学与工程学院，广东 韶关 512005；2.韶关学院粤北生猪生产及疾病防控协同创新发展中心，广东韶关 512005；3.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

纤维素（cellulose）是由葡萄糖组成的大分子多 糖，属于最丰富的绿色可再生资源，且是自然界中含量最多、分布最广的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。纤维素是植物细胞壁的主要成分，其结构致密、含有大量氢键且存在结晶区，不溶于水和一般有机溶剂，只能由纤维素酶水解成单糖才能被人和动物所利用，因此，纤维素的有效利用仍存在不少生物障碍。我国每年有10亿t以上的纤维素物质，其中大部分没有得到充分利用，若该资源有50%被加以利用，就能生产出1.0×107t的酒精[1]。可见，纤维素如能充分被人类利用或转化，将为社会带来巨大的经济效益，甚至大大改变当今世界能源需求的结构与格局。

单胃动物体内缺乏β-葡萄糖苷酶，纤维素不能被降解成葡萄糖，难以被机体有效吸收与利用。但纤维素可被大多数草食动物、软体动物、高等植物、昆虫、细菌、放线菌和真菌高效降解与吸收，用于自身的营养需求与生长发育，究其原因是以上生物体内能产生降解纤维素的纤维素酶。纤维素酶在自然界分布非常广泛，除了存在于上述生物体内外，还在反刍动物的瘤胃、草食动物盲肠及猪大肠中有产纤维素酶的细菌存在；而单胃动物因缺乏产生纤维素酶的能力，故对于纤维素的吸收与利用非常有限。

截至目前，关于分解纤维素的微生物资源中，真菌是研究最多的一类[2]，而有关细菌的研究主要是从特殊环境中分离出来的细菌菌株[3～6]。当前，利用微生物产纤维素酶菌将纤维素降解为单糖，并用以解决环境污染、能源短缺及动物消化效率所带来的世界性难题，已经成为各国专家研究的重点[7]。对国内外现有的研究进行分析后发现，限制纤维素资源应用的主要因素之一是产纤维素酶菌活性普遍不高[8]。因此，对纤维素资源的高效利用，其关键是进一步寻找和开发高产纤维素酶能力的菌种，并实现产业化推广。

家兔为草食动物，消化道内含有自身肠道或外源摄入的产纤维素酶菌，能利用较高纤维素含量的植物作为食物来源，因此，其新鲜粪便中不仅存在大量未被利用的纤维素残渣，还携带着来自肠道或外界的产纤维素酶菌。以普通家兔粪便为样本，参照孙佑赫等[9]的分离方法稍做改进，以期从兔粪中分离筛选出具有高产纤维素酶能力的菌株，为进一步开发高产纤维素酶菌种服务于现代化畜牧业生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 兔粪 样品为取自韶关市浈江区某肉兔养殖场健康成年兔的新鲜粪便。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 分离培养基（Luria-Bertani，LB）。分别称量蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g和琼脂8 g，放入到500 mL锥形瓶中，加蒸馏水500 mL，调节pH值至中性[10，11]。在瓶口加入1条棉线，用锥形瓶塞塞紧，用报纸和橡皮筋包扎好，高压蒸汽灭菌20 min。趁热倒板，待其冷却后放入冰箱内备用。

1.1.2.2 纯化培养基。与分离培养基相同。

1.1.2.3 产纤维素酶菌筛选培养基。分别称量羧甲基纤维素钠 （CMC-Na） 5 g、（NH4）2SO42 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、蛋白胨0.5 g和琼脂8 g，放入到500 mL锥形瓶中，加蒸馏水至500 mL，pH值自然。在瓶口加入1条棉线，用锥形瓶塞塞紧，用报纸和橡皮筋包扎好，高压蒸汽灭菌20 min。趁热倒板，待其冷却后放入冰箱内备用。

1.1.3 试剂 试剂有0.1%刚果红染色液、1 mol/L NaCl溶液、草酸铵结晶紫染色液、150 mg/mL革兰氏碘溶液、碱性复红染色液和95%酒精等，均由韶关学院英东农业科学与工程学院动物科学实验室提供。

1.1.4 仪器与设备 主要仪器设备有LX-01.50L高压灭菌锅（购于北京华威兴业科技有限公司）、MP1100B电子分析天平（购于上海恒平科学仪器有限公司）、BCD-206ZM2B冰箱（购于合肥美菱股份有限公司）、超净台（购于苏州安泰空气技术有限公司）、生化培养箱、电热干燥箱（购于上海申光仪器仪表有限公司）和光学显微镜等。所用玻璃器具先用自来水冲洗干净，晾干后用报纸和橡皮筋包扎好，高压蒸汽灭菌15～20 min，然后放在干燥箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与纯化 称量新鲜兔粪样品2.41 g，用无菌水溶解成20 mL，取上清液作为原液，待用。分别取原液以及稀释浓度梯度10-2、10-4和10-6的样液，在分离培养基（LB）上进行涂布分离，各稀释浓度均重复3次，置培养箱中37℃倒置黑暗厌氧培养48 h。挑选形态不同的菌落进行划线纯化，同样条件培养48 h。

1.2.2 产纤维素酶菌的筛选 将纯化后的菌株采用点接法接种于产纤维素筛选培养基中，置培养箱中37℃倒置培养72 h。采用刚果红染色法鉴定产酶能力，并筛选出产酶能力较强的菌株：在平板培养基中倒入0.1%刚果红染色液5 mL，染色30 min后倒出染液，并用1 mol/L的NaCl溶液5 mL脱色20 min，观察平板培养基中未染色的透明区域，用卡尺测定透明圈直径（D） 和菌圈直径（d），筛选透明圈直径与菌圈直径比值（D/d）较大的菌株进行后续研究。

1.2.3 革兰氏染色（Gram Stain） 和制片 取D/d较大的菌株作为样本，均匀涂布于玻璃片上，火焰固定，制成抹片。滴加草酸铵结晶紫染色液，处理1～2 min，水洗；加革兰氏碘溶液于抹片上，作用3min，水洗；随后用95%酒精进行脱色，作用1 min，水洗；加碱性复红液复染30 s，水洗，烘干制成标本[12]。

1.2.4 产纤维素酶菌株的鉴定 将标本在油镜下进行革兰氏染色鉴定和形态学鉴定，记录并拍照。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

培养48 h后，从兔粪样品中分离出乳白和金黄2种颜色的菌落（图1）。其中，乳白色菌落占优势，菌落形态呈圆形凸起，表面有光泽，边缘圆滑整齐、无渗出液；金黄色菌落在培养基上呈零星分布，菌落形态呈圆形凸起，表面有光泽，边缘呈锯齿状、无渗出液。从中挑选出形态各异的菌株48株，于37℃纯化培养48 h，均能正常生长。

图1 分离培养的菌落Fig.1 Isolated and cultured colonies

2.2 产纤维素酶菌的筛选

经刚果红染色并脱色后发现，CMC-Na培养基均呈红色（图2），其中，5个培养基中出现了水解的透明圈共8个，即具有产纤维素酶能力的细菌只有8株。

图2 刚果红染色后的产纤维素酶菌Fig.2 Cellulose producing bacteria by Congo red stain

对这8株细菌的透明圈和菌圈直径进行测量，结果（表1）显示，各菌株的透明圈和菌圈直径及其比值差别较大，其中，SK1和SK6菌株的D/d＞4，明显＞其他菌株。表明SK1和SK6菌株的纤维素酶活性显著高于其他菌株。因此，挑选出SK1和SK6作为最终目标产纤维素酶菌株进行后续研究。

表1 菌株的透明圈和菌圈直径及其比值Table 1 Ratios of transparent circle diameter to colony diameter

2.3 产纤维素酶菌的形态学鉴定

革兰氏染色后进行镜检，结果（图3和4） 显示，SK1和SK6两目标产纤维素酶菌菌株均呈蓝紫色，杆状。表明二者革兰氏染色均为阳性。故初步得出目标菌株均为革兰氏阳性菌（G+菌），且为杆菌[13～15]。

图3 革兰氏染色后的SK1菌株Fig.3 SK1 strain after Gram’s stain

图4 革兰氏染色后的SK6菌株Fig.4 SK6 strain after Gram’s stain

3 结论与讨论

3.1 讨论

3.1.1 水解圈与酶活性 产纤维素酶菌可以通过刚果红染色法来进行快速鉴定与简便筛选，该菌的产纤维素酶能力可根据透明圈直径与菌落直径的比值（D/d）直接反映，原理是刚果红是一种能够与大分子多糖相结合的染色剂，使用后与大分子多糖的纤维素结合形成红色。CMC平板内的纤维素被产纤维素酶菌产生的产纤维素酶水解，形成了小分子还原糖，所以经刚果红染色后，没有被水解的纤维素与刚果红结合呈现红色，而水解部分由于缺少大分子多糖，不能与刚果红作用染成红色，而是呈现出未染色的透明圈。因此，透明圈直径与菌圈直径的比值反映了纤维素酶的活性和菌落的产酶能力，比值越大表示酶活越强，反之越弱。本研究中，经过刚果红染色并脱色后发现，5个培养基中共出现了8个水解透明圈，即筛选出8株具有产纤维素酶能力的细菌。

3.1.2 革兰氏染色鉴定 从化学组成和生理性质上来说，革兰氏阳性菌（G+菌） 和革兰氏阴性菌（G-菌）存在明显差别，其染色结果也不一样。G+菌体内含有独特的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，能与碘和结晶紫的复合物牢牢地结合，不易脱色；而G-菌与该复合物结合程度较低，吸附染料的效果很差，极易被酒精脱色。因此，G+菌染色反应呈蓝紫色，G-菌染色反应呈红色。

家兔属草食性动物，其饲料大部分是植物成分，所以，兔粪中存在大量的来自外界和肠道中的产纤维素酶菌。本研究以普通家兔新鲜粪便为样本，从中分离出2种菌落形态不同的细菌。新鲜兔粪中存在一些肠道内的细菌，而在肠道微生态环境中生存的细菌大多是不可培养的，因此，分离出的细菌仅仅是其中的一部分[16]。从分离出来的细菌中按照比例挑选48株，并接种到产纤维素酶菌筛选培养基中进行进一步的筛选，72 h后通过刚果红染色法对CMC培养基进行染色，脱色后各平板上共出现8个大小不一的透明水解圈，即有8株菌株具有产纤维素酶菌的能力，挑选率为16.67%。本研究条件下挑选率较低，分析原因是进行筛选培养时没有采取黑暗培养，部分细菌由于离开了肠道的黑暗厌氧环境，在有氧的情况下影响了其正常的生命活动，导致其死亡或产酶能力下降等。对筛选出的菌株进行D/d分析，结果显示，有2株菌株D/d＞4.00，产纤维素酶活性较高。选择这2株细菌作为目标菌株进行革兰氏染色鉴定，二者均为革兰氏阳性菌（G+菌），形态为短棒状，属于杆菌。

产纤维素酶菌在世界上分布十分广泛，发掘与研究不同的产纤维素酶菌对人类更好地利用纤维素资源具有重要意义。对兔粪中存在的产纤维素酶菌进行初步研究，目的是为今后研究与利用兔粪中的产纤维素酶菌提供科学理论和奠定基础。

3.2 结论

从普通家兔新鲜粪便中分离并筛选出了具有较高酶活性的产纤维素酶菌菌株SK1和SK6，采用革兰氏染色初步鉴定为革兰氏阳性菌（G+菌），属于杆菌。从本研究中得到提示，利用兔粪可分离筛选出具有较高酶活的产纤维素酶菌，若能加以开发利用将具有较高的市场价值与应用前景。

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