土霉素降解菌的筛选及其降解条件优化

于 浩, 李 晔, 程全国(沈阳大学 环境学院, 辽宁 沈阳 110044)

土霉素降解菌的筛选及其降解条件优化

于 浩, 李 晔, 程全国
(沈阳大学 环境学院, 辽宁 沈阳 110044)

利用富集培养的方法,将采自葫芦岛市某畜禽养殖堆肥场周边土壤样品进行分离纯化并筛选出土霉素优势降解菌株(命名为YH1),通过形态观察,菌落边缘不整呈灰白色中心凸起似草帽状,采用16S rDNA 基因序列分析该菌株为短波单胞菌属(Brevundimonassp.),并对培养条件与降解特性进行优化,该菌株在温度30 ℃、pH值为6.0、土霉素质量浓度300 mg/L、装液量80 mL时,降解率最高可达到70.34%.此外,添加不同的碳源或氮源和金属离子对菌株降解能力均有影响,其中加入2 g/L可溶性淀粉,麦芽糖时可提高菌株的降解率,添加1 g/L的Fe3+和Cu2+时可提高菌株的降解率;而Cd2+、Mn2+可明显抑制其降解率.

土霉素; 微生物降解; 条件优化; 16S rDNA

随着我国畜禽养殖业的发展过快,并且由于其养殖过程中所产生的粪便污染问题日趋严重,已经威胁到农业可持续发展.四环素类抗生素结构复杂,特别难降解,容易在水环境中积蓄,由于其广泛应用于畜牧养殖业中,对人类生存环境以及生态可持续发展影响深远,世界许多国家已将抗生素污染列为重要的环境问题展开了相关的基础研究[1].我国是抗生素使用和生产大国,每年抗生素的使用超过8 000 t用于动物养殖业[2].而作为畜禽及水产养殖中被广泛应用的一种广谱抗生素土霉素,它作为四环素类抗生素,是全球销量最大的抗生素类药物之一,大量的应用已导致药品在环境中的大量残留.根据药物管理局和美国食品统计数据显示,美国在2011年用于国内动物食品生产的抗菌剂超过1.35万t[3],其中占美国畜禽养殖业使用总量42%的是四环素类抗生素,使用量达0.56万t.在肯尼亚畜禽养殖业中四环素类抗生素使用总量占56%,使用量达14.6 t[4].四环素类抗生素是我国畜禽粪便中经常检出的抗生素类群,不同学者在北京、山东、上海、浙江、江苏、吉林、陕西、宁夏等地的畜禽养殖场粪便中检出四环素类抗生素残留[5].本研究在葫芦岛市畜禽养殖场周边土壤中分离出1株能对土霉素高效降解的菌株,本试验对该菌株对土霉素的降解活性及生长条件等进行了研究.旨在为进一步消除环境中的土霉素残留问题,畜禽粪便快速无害化处理技术提供一定的技术支撑,为后续的深入研究提供更多的基础数据[6].

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试样品:葫芦岛市畜禽养殖堆肥场周边土壤样品用自封袋分装后-20 ℃保存.基本理化性质的测定:将样品风干后,过筛,并准确称取一定量过筛后的样品,加入试剂消煮完毕冷后,移取消煮液至三角瓶中,采用常规方法进行测定.

表1 样品的基本理化性质测定Table 1 Determination of basic physical and chemical properties of samples

1.2 试 剂

土霉素原粉(100 mg/瓶),土霉素检测试剂盒.三氯甲烷和正己烷均为国产分析纯试剂.EDTA-Mcllvaine缓冲液(无水Na2HPO42.84 g,定容于100 mL,柠檬酸2.1 g,定容于100 mL,取上述柠檬酸溶液100 mL和Na2HPO462.5 mL混合后,调pH值至4.0,再加入6.05 g EDTA-二钠,混匀,超声溶解.)

灭菌无机盐培养基:MgSO40.1 g,K2HPO41.79 g,KH2PO40.45 g,超纯水1 L,pH7.4,121 ℃湿热灭菌30 min.

富集培养:土霉素母液加入灭菌后的无机盐培养基中,使土霉素质量浓度分别为50、100、150、200 mg/L每7 d为一个驯化周期.将取回的土样于37 ℃、165 r/min震荡培养,分别加入上述不同土霉素质量浓度的富集培养其中,共驯化28 d.

1.3 菌株的初步筛选与分离纯化

将上述富集培养后的菌液,取上清液0.2 mL涂布于含一定量土霉素的固体筛选培养基上进行培养,不断地进行纯化,直至得到单一稳定的纯菌株,之后将菌种进行编号保存.

1.4 形态观察及菌株鉴定

将分离纯化后得到的降解菌涂布于固体平板培养基上,置于30 ℃恒温培养箱中培养72 h,通过菌落形状、大小、颜色、表面特征观察菌体形态.

将培养后的纯菌株采用Ezup柱式细菌基因组抽提试剂盒(SK8255)进行菌株DNA抽提,并将其作为模板,进行16S rDNA-PCR扩增,通用引物为27F/1492R,25 μL反应体系,其扩增产物采用SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒回收.测序由上海生物工程有限公司进行,扩增片段全长1 323 bp,将所测的数据在Genebank数据库中进行BLAST比对.

1.5 菌株降解条件的优化

分别采用不同培养条件初始pH值、温度、接种量、通气量、底物浓度、外加碳源、氮源、金属离子等对检测菌株生长情况以及土霉素降解速率的影响因素进行分析.以上每个处理均设3次重复.

1.6 土霉素降解能力的测定

将上述分离纯化后的菌株分别加入配制好的土霉素不同质量浓度的无机盐培养基中,37 ℃、165 r/min震荡培养,取2 mL培养液,加入6 mL EDTA-Mcllvaine缓冲液,然后分别加入1 mL三氯甲烷,1 mL正己烷,摇晃2 min,超声1 min使均质,5 000 r/min离心10 min,取上清液经0.45 μm水系微孔滤膜过滤,滤液装于2 mL离心管中,用于分析土霉素降解检测.筛选出降解能力强的高活性优势菌株并进行菌种鉴定.

1.7 菌株生长情况检测

采用微量紫外分光光度仪OD600 nm测定菌株含量.首先取处于对数期的菌株液体培养基于离心管中,离心弃上清,沉淀采用无菌生理盐水洗涤,无菌水稀释后上机测定.

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选与鉴定

经初筛与菌株的分离纯化后,共筛选出5株能在较高质量浓度土霉素富集培养基上生长的菌株,经降解能力复筛后得到1株对土霉素降解能力最优的菌株,命名为:YH1.对YH1菌株进行形态学观察,菌落边缘不整呈灰白色中心凸起似草帽状,经16S rDNA 基因序列分析后,根据其分类地位确定为短波单胞菌属(Brevundimonassp.)(见图1、图2).

图1 YH1菌株DNA的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agrose gel electrophoresis of total DNA from YH1 strain

图2 YH1菌株16S rFDNA PCR的扩增结果Fig.2 16S rDNA amplification fragment of YH1 strain

2.2 菌株的生长和土霉素降解条件优化

2.2.1 温度、pH值、通气量、接种量、底物浓度和不同碳源、氮源

在不同的温度和pH值下将菌株接种于筛选培养基培养振荡72 h后.结果表明,菌株的生长状况良好并且最强降解率达69.34%和69.98%时培养温度为30 ℃,pH值为6.0(见图3、图4).

图3 温度对YH1菌株降解土霉素能力的影响Fig.3 Effect of temperature on the degradation of oxytetracycline by YH1 strain

图4 pH值对YH1菌株降解土霉素能力的影响Fig.4 Effect of pH value on the degradation of oxytetracycline by YH1 strains

好氧微生物生长的重要条件就是通气量.本研究中采取装液量的不同来改变250 mL三角瓶中的空气量.以达到检测不同通气量影响的目的.结果表明,土霉素的降解速率最快可达70.34%;菌株生长质量浓度为0.29 mg/mL时装液量为80 mL(见图5).所以,考虑和设计好最佳装液量在实际降解应用中是有意义的.

菌株的接种量也可以影响土霉素的降解效率,当细菌接种量为10 mL/L时,土霉素的降解速率最快达69.56%,随着细菌接种量的增加,土霉素的降解速率逐渐降低(见图6).本试验选定10 mL/L为最佳接种量.菌株接种在不同质量浓度土霉素的无机盐培养基中,30 ℃振荡培养72 h后,测定菌株的生长和对土霉素的降解情况.结果表明,当培养基中土霉素质量浓度为300 mg/L时,土霉素降解率达67.71%;细菌生长质量浓度达到最大为0.06 mg/mL(见图7).

图5 通气量对菌株降解土霉素能力的影响Fig.5 Effect of ventilation rate on the degradation of oxytetracycline by strain

图6 细菌接种量对菌株降解土霉素能力的影响Fig.6 Effect of bacterial inoculation amount on the degradation of oxytetracycline by strain

图7 土霉素浓度对菌株降解土霉素能力的影响Fig.7 Effect of oxytetracycline concentration on the degradation of oxytetracycline by strain

在含土霉素300 mg/L的无机盐培养基中,分别添加2 g/L的(葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖或蔗糖)作为唯一碳源,或2 g/L的(酵母浸液、牛肉膏或蛋白胨)作为唯一氮源;将接种后的菌株培养72 h后,测定每一处理后的菌株生长性况及其对土霉素的降解能力分析.结果表明,添加不同的碳源、氮源均有利于该菌株对土霉素的降解能力,其中加入蔗糖和麦芽糖可以明显提高降解率,添加麦芽糖后降解率提高至71.89%,添加酵母浸液后降解率提高至64.91%;同时,添加可溶性淀粉和蛋白胨后,细菌生长质量浓度也明显增加,分别达到0.84和0.87 mg/mL(图8).

2.2.2 金属离子

环境中通常会含有一些金属离子,它们会对微生物生长提供所需要的元素也可能对微生物降解底物产生抑制作用.本试验在含土霉素300 mg/L的无机盐培养基中分别添加1 g/L的金属离子(Cu2+,Mn2+,Fe3+,Cd2+,Zn2+和Pb2+),在接种菌株,30 ℃振荡培养72 h后,测定菌株的生长和对土霉素的降解情况.结果表明,添加1 g/L的Cu2+和Fe3+可促进菌株的生长并提高对土霉素的降解率,如添加Fe3+,Cu2+降解率分别达72.21%和66.56%,菌株生长质量浓度也分别达0.78和0.67 mg/mL,而重金属离子Pb2+明显抑制微生物的生长(图9).

图9 金属离子对菌株降解土霉素能力的影响Fig.9 Effects of metal ions on the degradation of oxytetracycline by strain

3 结 论

(1) 采自葫芦岛市某畜禽养殖堆肥场周边土壤,并从中分离得到1株土霉素高效降解菌YH1,经过形态学观察和16S rDNA基因序列分析,初步鉴定该菌株为短波单胞菌属(Brevundimonassp.).

(2) 分别采用培养温度30 ℃、pH6.0,土霉素质量浓度300 mg/L,装液量80 mL时,菌株能在72 h内对质量浓度为300 mg/L的土霉素降解67.71%以上.其中加入2 g/L可溶性淀粉,麦芽糖影响更显著,土霉素降解分别为70.34%、71.89%,由此可见添加不同的碳源或氮源均有利于细菌对土霉素的降解.,由此可见金属离子对菌株降解土霉素的速率亦有影响.当添加1 g/L的Fe3+和Cu2+时亦可提高菌株对土霉素的降解率分别为72.21%、66.56%,由此可见金属离子对菌株降解土霉素的速率亦有影响.而Cd2+、Mn2+可明显抑制细菌对土霉素的降解率.综上所述该土霉素降解菌株具有环境适应能力强,降解效率高,底物范围广等优点.

菌株是来源于实际污染的土壤中进行分离纯化而获得的,一株能降解土霉素的短波单胞菌(Brevundimonassp.).由于本试验是在室内选择不同的温度、培养基pH值、底物浓度、通气量、添加碳源或氮源及金属离子等进行的研究该菌株对土霉素的降解作用,而在实际降解无害化处理过程中的影响因子更多,故对其能否在实际畜禽粪便无害化资源化处理过程中应用还有待于进一步探讨.根据新华社媒体报道,“十三五”规划纲要中100个重大工程项目,包括开展1 000万亩受污染耕地治理和4 000万亩受污染耕地风险管理.个人认为,政策明确了土壤修复目标,特别是将此前被市场认为最缺乏盈利模式的耕地纳入其中,体现出较大政策力度.本研究筛选的菌株对土霉素具有良好的降解效果,研究结果具有潜在的实际应用价值,为进一步降解畜禽粪便中的土霉素奠定了基础,为后续的深入研究提供更多的基础数据.

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[3] Food and Drug Administration. FDA annual report on antimicrobialssold or distributed for food-producing animals in 2011[R]. Rockville, MD: The US Food and Drug Administration, 2011.

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【责任编辑: 胡天慧】

Screening and Optimization of Degradation Condition of Oxytetracycline Degrading Bacteria

YuHao,LiYe,ChengQuanguo

(College of Environment, Shenyang University, Shenyang 110044, China)

An oxytetracycline-degrading strain from the soil of poultry breeding farms in Huludao City was isolated by enrichment culture method and its degradation conditions were optimized. The strain named YH1 was identified based on the morphology observation; the colony morphology was gray, irregular margin, and the center was raised like a straw hat. By 16S rDNA gene sequence, the preliminary identification suggested that the strain belonged to Brevundimonas sp. When the temperature was 30 ℃, pH was 6.0, and mass concentration of oxytetracycline was 300 mg/L, the degradation rate of the bacterial strain was up to 70.34%. Adding different carbon or nitrogen sources and metal ions had an impact on the degradation of strains; when 2 g/L soluble starch and maltose were added, the degradation rate of the strain was increased; when 1 g/L of Fe3+and Cu2+was added, the degradation rate of the strain was increased; while Cd2+and Mn2+could inhibit the degradation rate.

oxytetracycline; microbial degradation; condition optimization; 16S rDNA

2016-09-29

国家自然科学基金资助项目(31470552); 辽宁省教育厅资助项目( L2012405).

于 浩(1990-),男,辽宁沈阳人,沈阳大学硕士研究生.

2095-5456(2017)01-0021-05

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