白头翁汤正丁醇提取物诱导白念珠菌生物被膜细胞凋亡

施高翔 汪云霞 冯鑫 邵菁 汪天明 汪长中

(1.安徽中医药大学中西医结合临床学院，合肥 230038;2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，合肥 230038)

·论著·

白头翁汤正丁醇提取物诱导白念珠菌生物被膜细胞凋亡

施高翔1，2汪云霞1，2冯鑫1，2邵菁1，2汪天明1，2汪长中1，2

(1.安徽中医药大学中西医结合临床学院，合肥 230038;2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，合肥 230038)

目的 探讨白头翁汤正丁醇提取物 (Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction,BAEB)对白念珠菌生物被膜细胞凋亡的影响。方法 分别以DCFH-DA染色和JC-1染色，用流式细胞仪检测白念珠菌生物被膜细胞内活性氧 (ROS)水平和线粒体膜电位 (MMP)变化；Annexin V-FITC/PI染色染色荧光显微镜观察白念珠菌生物被膜细胞磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine，PS)外翻并检测凋亡率；FITC-VAD-FMK染色观察白念珠菌生物被膜细胞metacaspase活性；DAPI染色观察白念珠菌生物被膜细胞核形态。结果 ≥128 μg/mL BAEB处理后白念珠菌生物被膜细胞内活性氧水平显著升高，线粒体膜电位显著降低，PS外翻增加，凋亡率明显升高，metacaspase酶活性显著升高，细胞核出现固缩和碎裂。结论 白头翁汤正丁醇提取物可诱导白念珠菌生物被膜细胞凋亡。

白头翁汤正丁醇提取物；白念珠菌；生物被膜；凋亡

白念珠菌是存在于人体皮肤或腔道的一种条件致病性真菌，当长期使用抗生素造成机体菌群失调，或使用免疫抑制剂及患有艾滋病等疾病造成抵抗力下降时，白念珠菌即可致病[1-2]。目前临床上常用的抗真菌药物不仅种类少、毒副作用较大，且容易产生耐药性。日渐严重的耐药现象已成为抗真菌治疗最棘手的问题，而耐药主要原因之一在于真菌生物被膜的形成[3]。本课题组前期研究发现，白头翁汤正丁醇提取物 (Butyl alcohol exertact of Bai Tou Weng decoction,BAEB)对白念珠菌生物被膜形成具有较强的抑制作用[4]，但BAEB是否能通过促进凋亡方式来抑制生物被膜尚不明确。本实验在前期研究的基础上，进一步探讨BAEB对白念珠菌生物被膜细胞凋亡的影响，为其抗白念珠菌感染提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌C.albicansSC5314，由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。

药物 白头翁汤按国家中医药管理局统一组织编审的普通高等类教育中医类规划教材《方剂学》中的药物 (白头翁、黄柏、黄连、秦皮)组成，购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经鉴定。使用80%乙醇70℃回流3 h后过滤，收集滤渣，共重复回流3次后，滤液用正丁醇按照极性梯度萃取3次，萃取液65℃旋转蒸发至结晶干燥，得到白头翁汤正丁醇提取物；两性霉素B (博美生物科技)。

试剂 PBS缓冲液 (pH 7.0±2.0)；二甲基亚砜 (Dimethyl Sulphoxide，DMSO，国药集团)；RPMI-1640培养基 (life technologies公司)；DAPI (Sigma公司)；蜗牛酶 (Sigma公司)；AnnexinV/FITC试剂盒 (上海贝博生物)；FITC-VAD-FMK (Promega公司)；活性氧检测试剂盒 (Solarbio公司)；线粒体膜电位检测试剂盒 (Solarbio公司)。

仪器 恒温培养箱 (上海博迅实业公司)；流式细胞仪 (Flow Cytometer，BD Accuri C6)；倒置荧光显微镜 (Olympus IX81，Japan)。

2 方 法

2.1 白念珠菌的活化及菌液的配制[5]

用接种环从4℃保存的SDA培养基上挑取C.albicansSC5314单菌落接种于沙氏液体培养基中，35℃摇床过夜培养，使白念珠菌处于对数生长期，离心收集菌体，PBS洗2次后，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养基将菌液稀释到2×106CFU/mL备用。

2.2 白念珠菌生物被膜细胞的凋亡诱导及脱壁处理获取[6-7]

将2 mL (浓度为2×106CFU/mL)的菌悬液接种于24孔培养板，同时将2 mL白头翁汤正丁醇提取物 (终浓度256、128、64 μg/mL)分别加入孔板中，另设不加药的空白组和阳性对照药两性霉素B (0.5 μg/mL)，37℃静置孵育16 h，无菌PBS洗2次，然后对各组细胞进行脱壁处理：加脱壁促进剂 (50 mmol/L K2HPO4，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L DTT)，37℃、100 r/min摇床孵育30 min，无菌PBS缓冲液洗2次后，转移至1.5%蜗牛酶溶液中，30℃、100 r/min摇床孵育45 min，无菌PBS缓冲液洗2次后，得脱壁的原生质体状态的白念珠菌。

2.3 AnnexinV-FITC/PI染色[8]

将经上述药物凋亡诱导并经过脱壁处理的C.albicansSC5314生物被膜细胞用无菌PBS洗2次，以400 μL 1×Annexin V结合液重悬细胞，再加5 μL Annexin V-FITC染液，轻轻混匀后于4℃避光孵育15 min，对细胞膜上的PS进行标记；再加入10 μL PI染液混匀继续孵育5 min，对死细胞进行染色。于荧光显微镜观察PS外翻情况并拍照，同时以流式细胞仪检测凋亡率。

2.4 Caspase活性的测定[9]

将经上述药物凋亡诱导并经过脱壁处理的C.albicansSC5314生物被膜细胞，离心收集细胞，无菌PBS洗3次，加100 μL的10 μmol/L的FITC-VAD-FMK于30℃避光染色1 h，均匀涂布在含有多聚赖氨酸的载玻片上，置于荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 DAPI染色

将上述药物凋亡诱导并经过脱壁处理的C.albicansSC5314生物被膜细胞以70%乙醇固定渗透10 min，3 000 r/min离心5 min收集，无菌PBS缓冲液洗2次后加入10 μg/mL的DAPI，室温避光染色20 min。取20 μL菌悬液置于含有多聚赖氨酸的载玻片上，室温黏附5 min后，再用10%甲醛固定10 min，以无菌PBS缓冲液轻洗3次后置于荧光显微镜下观察并拍照。

2.6 流式细胞术检测活性氧 (reactive oxygen species，ROS)

在脱壁的原生质体菌悬液中，按照试剂盒说明书加入DCFH-DA试剂，37℃细胞培养箱孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和生物被膜细胞充分接触。再以PBS洗涤细胞3次后用流式细胞仪检测DCFH-DA的荧光强度，该值代表ROS水平。

2.7 流式细胞术检测线粒体膜电位 (mitochondrial membrane exponential，MMP)

参照线粒体膜电位检测试剂盒说明书加入JC-1试剂，于37℃细胞培养箱孵育20 min后，吸除上清，用其染色缓冲液洗涤2次，用流式细胞仪检测生物被膜细胞线粒体膜电位 (MMP)水平。

计量资料以 (均数±标准差)表示，所有数据使SPSS 17统计软件分析处理，组间差异比较采用单因素方差分析检验。

3 实验结果

3.1 BAEB可显著提高白念珠菌生物被膜细胞内活性氧水平

本实验用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。实验结果显示 (见图1)，相比于空白组 (0.7%阳性率)，64、128、256 μg/mL BAEB和0.5 μg/mL AmB干预后，可提升1.5%、2.8%、5.1%和11.5%的活性氧水平 (P<0.05)。

3.2 BAEB可显著降低白念珠菌生物被膜细胞线粒体膜电位 (MMP)

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变 (FL2/FL1的比值)可检测到细胞膜电位的变化。实验结果显示 (见图2)，与空白组FL2/FL1值 (2.8)相比较，0.5 μg/mL AmB使FL2/FL1降低为1.06、64、128和256 μg/mL BAEB,能剂量依赖性的降低白念珠菌生物被膜细胞内的膜电位，FL2/FL1值分别为2.01、1.81和1.63 (P<0.05)。

图1 流式细胞仪检测BAEB对C.albicansSC5314生物被膜细胞ROS的影响 (*.P<0.05)：A.空白组，B.0.5 μg/mL AmB，C.64 μg/mL BAEB，D.128 μg/mL BAEB，E.256 μg/mL BAEB 图2 流式细胞仪检测BAEB对C.albicansSC5314生物被膜细胞MMP的影响 (*.P<0.05)

Fig.1 Flow cytometric analysis of ROS accumulation in BAEB treatedC.albicansSC5314 biofilms cells with DCFH-DA staining (*.P<0.05) Fig.2 Flow cytometric analysis of MMP accumulation in BAEB treatedC.albicansSC5314 biofilm cells with JC-1 staining (*.P<0.05)

3.3 BAEB可诱导白念珠菌生物被膜细胞PS外翻和增加凋亡率

PS外翻是真菌凋亡的表现形式之一。PS在正常情况下分布于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。Annexin V (膜联蛋白)可以与暴露在膜外侧的PS特异性结合，利用荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

Application of a bias correction scheme for 2-meter temperature levels over complex terrain

实验结果如图3所示，空白对照组的细胞有少量的绿色荧光，且有红色的荧光，阳性对照药AmB组绿色荧光细胞最多。经BAEB处理后的细胞中，随着药物浓度的升高，绿色荧光细胞数量越多。表明PS已经从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，提示BAEB导致生物被膜细胞的凋亡。

同时，以流式细胞仪检测BAEB对生物被膜细胞凋亡率的影响，结果发现 (见图4)，相比于空白组凋亡率 (1.4%)，64、128、256 μg/mL BAEB和0.5 μg/mL AmB可引起3.7%、5.1%、8.3%和13.0%的白念珠菌生物被膜细胞凋亡 (P<0.05)。

图3 荧光显微镜观察BAEB对C.albicansSC5314生物被膜细胞磷脂酰丝氨酸 (PS)外翻的影响 图4 流式细胞仪检测BAEB对C.albicansSC5314生物被膜细胞凋亡率的影响 (*.P<0.05)：A.空白组，B.0.5 μg/mL AmB，C.64 μg/mL BAEB，D.128 μg/mL BAEB，E.256 μg/mL BAEB

Fig.3 Phosphatidylserine externalization recorded by fluorescence microscopic with Annexin V staining at the early stage of apoptosis inC.albicansdispersion cells of biofilms (×400):A-E.Phase cotrast;a-e.Annexin V;A,a.Control;B,b.0.5 μg/mL AmB;C,c.64 μg/mL BAEB;D,d.128 μg/mL BAEB;E,e.256 μg/mL BAEB Fig.4 Flow cytometric analysis with FITC-labeled Annexin V staining at the early stage of apoptosis inC.albicansbiofilms cells (*.P<0.05)

3.4 BAEB可激活白念珠菌生物被膜细胞metacaspase活性

Caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，主要负责选择性的切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。在C.albicans细胞中，存在Caspase同源结构类似物metacaspase，因此，在实验中选用FITC-VAD-FMK在原位检测metacaspase的活性。

实验结果如图5所示。空白对照组中见有极其微弱荧光的细胞。BAEB处理后的细胞，大部分被标记上明亮的绿色荧光，阳性对照药AmB的荧光亮度最为明显，说明BAEB激活了C.albicansSC5314细胞内的metacaspase。

3.5 BAEB可诱导白念珠菌生物被膜细胞核碎裂

DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。这种染料可以穿透细胞膜与细胞核中的双链结合而产生荧光。实验结果如图6所示。正常对照组的白念珠菌呈弥漫均匀的低强度荧光，经BAEB处理过的细胞呈现不同程度的核固缩或颗粒状荧光，正常的细胞出现均匀一致的荧光密度，而凋亡的细胞核呈现明显浓缩、核碎裂等现象。

4 讨 论

白念珠菌生物被膜是白念珠菌附着于活体组织或非活体组织表面、由自身产生的胞外多聚基质包裹的有特定结构和功能的聚合体，是菌体在长期进化过程中所表现出的为适应环境压力的另一种生存方式[10]。研究发现，在难治性真菌感染的病灶中多存在生物被膜感染源。生物被膜的形成会使病原菌对抗菌药物的敏感性降低，即产生耐药性。因此，如何控制生物被膜对于防治白念珠菌感染具有重要意义。

图5 荧光显微镜观察BAEB对C.albicansSC5314生物被膜细胞metacaspase酶活性的影响：a.空白组，b.0.5 μg/mL AmB，c.64 μg/mL BAEB，d.128 μg/mL BAEB，e.256 μg/mL BAEB (×400) 图6 荧光显微镜观察BAEB干预后C.albicansSC5314细胞核碎裂

Fig.5 Metacaspase activity observed by Fluorescence microscopic with FITC-VAD-FMK staining at the early stage of apoptosis inC.albicansbiofilms (×400) Fig.6 Nuclear damages recorded by Fluorescence microscopic with DAPI staining at the early stage of apoptosis inC.albicansbiofilms (×400):A-E.Phase cotrast;a-e.DAPI;A,a.Control;B,b.0.5 μg/mL AmB;C,c.64 μg/mL BAEB;D,d.128 μg/mL BAEB;E,e.256 μg/mL BAEB

细胞凋亡是细胞自主有序的死亡，是生物体普遍存在的过程。诱导或促进细胞凋亡不仅是治疗肿瘤的重要策略[11]，对抗真菌研究也有一定的借鉴意义。白念珠菌是单细胞真菌，对于其凋亡现象的研究目前较少。但近年来已发现，包括白念珠菌在内的真菌在某些因素的诱导下可以发生凋亡。Phillips等[12]最初观察到，乙酸在适当浓度下可诱导白念珠菌凋亡。AL-Dhaheri RS等[13]发现，两性霉素B干预后白念珠菌生物被膜细胞也出现凋亡。白念珠菌及其生物被膜细胞凋亡现象的发现，表明有望通过药物 (包括中药)诱导病原真菌的凋亡可能成为抗真菌的新策略。

中药复方白头翁汤由白头翁、黄柏、黄连、秦皮组成。白头翁入肝经，治疗厥阴湿热，为方中主药；秦皮亦入肝经，清热解毒，同时配合黄连、黄柏清热杀虫相得益彰，四药相伍协同作用治疗肝经湿热型念珠菌性阴道炎效果显著[14]。近年来，课题组对该复方采用多种溶剂萃取得到相应的提取物，经比较证实白头翁汤正丁醇提取物 (BAEB)抗白念珠菌的活性最强，可显著抑制白念珠菌其生物被膜的形成[15]，为本文进一步研究白头翁汤正丁醇提取物诱导白念珠菌生物被膜细胞凋亡提供了实验依据。

本实验结果显示，BAEB可显著提升白念珠菌生物被膜细胞内ROS的累积，降低MMP；Annein-V染色结果中表明，BAEB可诱导C.albicansSC5314磷脂酰丝氨酸外翻，而PS的外翻正是细胞凋亡的典型征兆之一。同时流式细胞仪检测证明，BAEB可显著增加白念珠菌生物被膜细胞的凋亡率，另经FITC染色的结果证明，BAEB激活了C.albicansSC5314细胞内的metacaspase；经DAPI染色的结果证明，BAEB促使白念珠菌生物被膜细胞呈现不同程度的核固缩、核碎裂或颗粒状荧光等现象，这些都是凋亡的明显特征。

综上，本研究首次报道BAEB可通过诱导细胞凋亡来发挥其抗白念珠菌生物被膜作用，为白头翁汤在临床上治疗白念珠菌生物被膜感染提供了重要依据，但其更深入的作用机制尚有待进一步揭示。

[1] Fischer G.Chronic vulvovaginal candiasis:what we knowand what we have yet to learn[J].Austalas J Dermatol,2012,53(4):247-254.

[2] Harriott MM,Lilly EA,Rodriguez T E,et al.Candidaalbicansforms biofilms on the vaginal mucose[J].Microbiology,2010,156(Pt 12):3635-3644.

[3] Lewis K.Multidrug tolerance of biofilms and persister cells[J].Curr Top Microbiol Immunol，2008,322:107-131.

[4] Zeng H,Tian J,Zheng Y,et al.Invitroandinvivoactivities of essential oil from the seed ofAnethumgraveolensL.againstCandidaspp[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2011,659704.doi:10.1155/2011/659704.

[5] Ramage G,Walle KV,Wickes BL,et al.Standardized methodforinvitroantifungal susceptibility testing ofCandidaalbicansbiofilms[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45 (9):2475-2479.

[6] AL-Dhaheri RS,Douglas LJ.Apoptosis inCandidaalbicansbiofilms exposed to amphoterincin B[J].J Med Microbiol,2010,59(Pt 2):149-157.

[7] Phillips A J,Sudbery I,Ramsdale M,et al.Apoptosis inducedby environmental stress and amphotericin B inCandidaalbicans[J].Proc Natl Acda Sci USA,2003,100 (24):14327-14327.

[8] Sharma M,Manoharlal R,Negi AS,et al.Synergistic anticandidal activity of purepolyphenol curcumin I in combination with azoles and polyenes generates reactive oxygenspecies leading to apoptosis[J].FEMS Yeast Res,2010,10(5):570-578.

[9] Tsubura A,Lai YC,Kuwata M,et al.Anticancer effects of garlic and garlic-derivedcompounds for breast cancer control[J].Anticancer Agents Med Chem,2011,11(3):249-253.

[10] 李秀丽,廖万清.真菌生物膜研究进展[J].中国真菌学杂志,2006,1(5):318.

[11] Lopez J,Tait SW.Mitochondrial apoptosis:killing cancer using the enemy with in[J].Br J Cancer,2015,112(6):957-962.

[12] 季宇彬.中药有效成分药理与应用[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,2004:60.

[13] 张梦翔,夏丹,施高翔,等.白头翁汤正丁醇提取物对碱性pH条件下白念珠菌VVC临床株形态转化的影响[J].中国中药杂志,2015,40(4):710-715.

[14] 张晓芬,刘银伟.白头翁汤加味综合治疗复发性念珠菌性阴道病[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(9):279-281.

[15] 张梦翔,陆克乔,夏丹,等.白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌VVC临床株体外生物膜形成的抑制作用[J].中国真菌学杂志,2015,10(6):321-327.

[本文编辑] 施 慧

Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction induced apoptosis inCandidaalbicansbiofilms

SHI Gao-xiang1，2,WANG Yun-xia1，2,FENG Xin1，2,SHAO Jing1，2,WANG Tian-ming1，2,WANG Chang-zhong1，2

(1.SchoolofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230038，China;2.InstituteofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，AnhuiAcademyofChineseMedicine，Hefei230038，China)

Objective To explore the Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction effect on apoptosis ofCandidaalbicansbiofilms.Methods Using DCFH-DA staining flow cytometry to detectCandidaalbicansbiofilm cells of reactive oxygen species (ROS) level;Using JC-1 staining of mitochondria ofCandidaalbicansbiofilm membrane flow cytometry to detect MMP;Phosphatidylserine externalization was recorded by fluorescence microscopic with Annexin V staining at the early stage of apoptosis inC.albicanscells of biofilms;Metacaspase activity was observed by Fluorescence microscopic with FITC-VAD-FMK staining at the early stage of apoptosis inC.albicanscells of biofilms;Observation onCandidaalbicansbiofilm morphology was performed by DAPI nuclear staining and fluorescence microscopy.Results The apoptosis ofCandidaalbicanssignificantly increased the proportion of more than 128 ug mL-1BAEB treatment,Caspase activity increased,nuclear pyknosis and fragmentation were observed.Intracellular ROS level was significantly increased,mitochondrial membrane potential decreased significantly.Conclusion The Butyl alcohol extract of BaiTou Weng decoction of certain concentrations could induce apoptosis ofCandidaalbicansbiofilm cells.

Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction;C.albicans;biofilms;apoptosis

13-18]

施高翔，男 (汉族)，硕士，助教.E-mail:ssjlsgx@163.com

汪长中,E-mail:ahwcz63@sina.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0013-06

2016-11-23