PCR实验室的污染与对策

阮艳秋

四川省自贡市第一人民医院检验科 四川自贡 643000

PCR实验室的污染与对策

阮艳秋

四川省自贡市第一人民医院检验科 四川自贡 643000

目的:探讨PCR实验室防止和处理污染的办法, 方法:从PCR技术对环境的要求和污染的3个来源分析污染的原因，提出应采取的控制方法和预防措施。结果：有效防止实验室污染，结论；PCR技术在不断发展，随着新技术的出现，PCR技术及其污染控制策略将会更加完善。

聚合酶链反应；污染；控制方法；预防措施

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是由美国Kary Mullis于1983年发明的[1]。该技术通过重复高温变性,低温退火,中温延伸等简单的3个温度循环,能将靶DNA扩增数百万倍,获得极高的检测敏感性.但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的结果[2].如果形成气溶胶污染而扩散,则可引起整个PCR实验室的污染,处理起来非常麻烦棘手,严重的甚至要关闭PCR实验室.我实验室也曾经遭遇过气溶胶的污染,所幸的是经过一段时间的处理,最终将PCR实验室污染排除掉了.现将经过向大家报告如下。

1.资料与方法

1.1 检测对象 本院感染科、内外科、妇产科、儿科及门病科患者82例，年龄9～76岁。

1.2 检测方法和仪器 乙型肝炎病毒的DNA检测方法，均采用达安基因公司 PCR-荧光探针法。试剂贮存和准备区有 BCJ一 1FD 型洁净工作台(上海博迅公司)；标本制备区BSC-1500II-B2-X

型生物安全柜(上海力申公司)、HC-3018高速冷冻离心机(安徽中科中佳公司)、XK96一A4型快速混匀器(姜堰新康仪器厂)、HB-100恒温金属浴（博日科技）；扩增产物分析区有FTC-2000型实时荧光定量PCR仪(上海枫岭公司)，3个区域均备有ZXC-II型紫外线消毒车(上海跃进器械厂)。

1.3 标本采集 无菌试管采集空腹静脉血 3mL，按说明书要求分离血清保存。

2 污染的发现

2013年8月5日,我实验室按正常的操作规程检测HBV标本，同时设立了阴性对照、阳性对照和质控，阴阳性对照均为试剂盒中配备，扩增结束分析结果时，发现HBVDNA所有的标本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过程中出现污，但具体是什么原因引起的污染还不清楚。

3.PCR实验室污染的监测和追踪

出现污染后，我们首先考虑可能是试剂的污染，更换新批号的HBVDNA试剂重新检测后,结果仍然为全部标本阳性.将HBV标本拿到其他正规的PCR实验室检测,结果标

本中阴、阳性结果都有，阴性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标本没有被污染，

将两种批号的HBV 试剂拿到其他正规的PCR实验室检测,也显示试剂没有问题.

我实验室用消毒液擦拭工作台面后,打开所有的紫外灯照射一天,将所使用微量进样器、离心、枪头进行重新消毒；手套、记号、记录本等都更换掉。再将HBV标本进行检测，结果全部标本仍然为阳性。

用消毒液擦拭工作台面后，打开所有的紫外灯照射一天，将HBV标本重新检测，同时设置了5个阴性对照，①试剂对照：将试剂的反应管从试剂盒中拿出，不开盖子，直接上机检；② 环境取样：用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源，用1ml去离子水浸泡，再取5ul做PCR实验。③气溶胶。可将一个或多个空管打开静置于标本制备 10～30分钟，然后加入扩增反应混合液，④不加任何试剂和样本，只有相同体积的水。结果是全部标本和②,③阴性对照为阳性,而①和④阴性对照为阴性。

4. 结果

基本可以排除试剂和仪器污染。推断为实验室气溶胶污染。后来经过调查，发现工作人员在操作过程中有一个强阳性标本溢出，污染了生物安全柜未及时消毒处理所致。

5.污染的排除

在确定了污染的原因后，我们就开始着手排除污染，每天

都打开整个PCR实验室的门窗和排气扇,让整个实验室换气通风，可起到空气稀释的作用，有利于 PCR产物留量的减少，加快实验室污染的排除。用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液

消毒液擦拭整个PCR实验室所有可能的污染源：实验台面、离心机、冰箱门把手、可疑器具等等!用消毒液对生物安全柜进行喷雾，使气溶胶沉降后,每天重复以上操作三至五次，下班后紫外灯通宵照射，一周后，重复检查所有转阴再投入使用，PCR实验室恢复正常。

6 分析讨论

PCR技术的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染。极其微量的污染就可造成假阳性结果，一旦发生污染，后果不堪设想。要消除污染就是要预见污染、承认污染和采取措施防止污染。通常我们对 PCR实验室污染的预防是采取操作分区、试剂的分装处理、移液器的使用、Eppendorf管、规范实验操作等规则,对污染的处理是用现配3%双氧水或 10%次氯酸钠溶液擦拭或浸泡;紫外线照射法[3]。而对于实验室的通风方面没有给予足够的重视，为了防止实验区间之间的相互污染，各个实验区间都是尽可能的密闭，从而使得实验室出现PCR产物残留污染的几率增大，从本次PCR实验室污染排除的过程来看，我觉得污染得以排除的一个关键是通风，适当的给予实验室通风，可起到空气稀释的作用，有利于 PCR产物残留量的减少，加快实验室污染的排除。

PCR技术在不断的发展，随着定量 PCR、荧光 PCR、巢式PCR、逆转录PCR，特别是生物芯片等技术的出现[4]，[5]，PCR技术及其污染控制策略将会更加完善。

开展 PCR必须具备一定的条件，为保证临床基因扩增检验技术的有效应用，在卫生部的指导下。经国内专家多次研究论证，并结合该技术在国内外的发展现状，卫生部于2002年1月14日正式发布了《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，卫生部临床检验中心也随后发布了《临床基因扩增检验实验室工作规范》等配套文件[6]。每个操作PCR实验的工作人员,必须要具有相应理论知识及操作培训合格证书,这也是确保实验室避免污染的重要基础。平时要注重实验室管理，严格遵循实验室的各项规章制度，积极参加相关知识培训，努力提升业务能力。本院在 2005年申报了临床基因扩增检验实验室评审，是四川省卫生厅颁发了评审合格证。这样使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，才能使 PCR技术在科研和临床工作中发挥更大的作用。

[1]朱忠勇.实用医学检验学[M].2版.北京：人民军医出版社，1997：1041.

[2] KwoK s,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J].Na-ture,1989,339(2):223-238.

[3]林万明,杨瑞馥,黄尚志.等.PCR技术操作和应用指南[M].第1版.北京:民军医出版社,1993:28-30.

[4] Or lando C.Developments in antiative PCR.Cl in.Chem Lab Med,1998,36:255-269.

[5]Whitcombe D.Advance in approaches to DNA based diagnostics.Curr Opin Biotechnol,1998,9:602-608.

[6]申子瑜，李金明.临床基因扩增检验技术[M].北京：人民卫生出版社,2002：176-186.

[7]李园,PCR实验室的消毒与防污染措施[J].检验医学与临床,2010.(7)3:285.

R 473.5

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1672-5018（2017）03-257-01