多被银莲花总皂甙对ACC-M细胞内Bcl-2与Bax蛋白表达的影响

晏震，陈彦平，刘现云

(1河北医科大学附属邢台市人民医院，河北邢台054001；2河北医科大学第四医院；3邢台医学高等专科学校)

多被银莲花总皂甙对ACC-M细胞内Bcl-2与Bax蛋白表达的影响

晏震1，陈彦平2，刘现云3

(1河北医科大学附属邢台市人民医院，河北邢台054001；2河北医科大学第四医院；3邢台医学高等专科学校)

目的 探讨多被银莲花总皂甙对人涎腺腺样囊性癌高肺转移细胞(ACC-M)内Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法 将体外培养的ACC-M细胞随机分为实验组与对照组，分别加入50 μg/mL多被银莲花总皂甙溶液2 mL、含同样浓度二甲基亚砜的 RPMI1640培养液2 mL。分别于培养24、48、72 h用Western blotting法检测细胞内Bcl-2和Bax蛋白的表达量。结果 对照组各时间点Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；实验组各时间点Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；两组间各时间点Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 多被银莲花总皂甙可上调ACC-M细胞内Bax蛋白表达，同时下调Bcl-2蛋白表达，导致Bax/Bcl-2升高。

涎腺腺样囊性癌；高肺转移细胞；多被银莲花总皂甙；B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白

涎腺腺样囊性癌(SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，该肿瘤易发生远处转移且术后具有较高的局部复发率。目前寻找不良反应小、可长期应用的抗肿瘤药物一直是口腔医学研究的重要课题之一。多被银莲花是毛茛科银莲花属植物的根茎，药理活性研究发现多被银莲花提取物有抗肿瘤、镇痛、抗氧化、抗惊厥及抑菌作用。目前研究表明,Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中发挥重要作用[1]。其中Bcl-2蛋白具有拮抗细胞凋亡作用称为癌基因，而Bax蛋白具有促进细胞凋亡作用称为抑癌基因。两种蛋白正常情况下处于相对稳定状态，但当细胞受到相关信号刺激时，两种蛋白的平衡被打破，则导致细胞凋亡或促进肿瘤产生。多被银莲花总皂甙对SACC高肺转移细胞(ACC-M)中Bcl-2和Bax蛋白表达有何影响，尚未见国内外文献报告。本研究于2014年3月～2015年3月对其进行探讨，为多被银莲花总皂甙治疗SACC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 ACC-M细胞，由北京口腔医院提供。多被银莲花总皂甙，取多被银莲花(石家庄乐仁堂药店)1 kg，粉碎后用95%乙醇室温浸泡3次，每次用乙醇5 L，回收乙醇，得到浸膏426.4 g；将浸膏放入800 mL水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次500 mL；将下层水溶液放进圆底烧瓶，加入25 g固体KOH，80 ℃加热水解2 h；用5%盐酸调pH值至6。再用正丁醇萃取4次，每次500 mL，合并萃取液，减压回收正丁醇，得总皂甙148.8 g，回收率为14.88%；用二甲基亚砜将多被银莲花总皂甙溶解配制成20 mg/mL的储存液，于4 ℃恒温冰箱储存。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液将储存液稀释为1、25、50、75、100 μg/mL浓度的使用液。

1.2 ACC-M细胞培养及药物浓度确定 将ACC-M细胞取出培养于含10%胎牛血清和抗生素的RPMI1640培养基中，将培养瓶放入CO2培养箱中培养，当细胞爬满瓶底壁的80%时即可进行传代。用吸管将细胞吹打制成细胞悬液并计数，细胞以1.0×105/mL接种于新的培养瓶中。取对数生长期细胞，经消化液消化后制成4.0×106/mL的细胞悬液。接种于培养瓶中，每瓶2 mL，于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中继续培养。采用MTT比色试验将对数生长期的ACC-M细胞移入96孔培养板中，培养24 h，分别加入浓度为1、25、50、75、100 μg/mL的多被银莲花总皂甙100 μL，并设置对照和调零孔，每组5个复孔。于培养24、48、72 h后，每孔加入5 g/L的预制MTT溶液20 μL，继续培养4 h弃上清液，再加入二甲基亚砜溶液200 μL避光振荡摇匀，用酶标仪测492 nm波长各孔的吸光度值。依据吸光度值计算各组的生长抑制率并通过作图法求出24、48、72 h的IC50值分别为 46.3、56.59、44.60 μg/mL，其最高抑制率可达90.3%，据此设定本实验银莲花总皂甙浓度为50 μg/mL。

1.3 ACC-M细胞内Bcl-2与Bax蛋白表达检测 采用Western blotting法。将贴壁后的细胞从培养箱中取出，弃培养液。随机分为实验组与对照组，每组设置3个复孔。实验组加入50 μg/mL的多被银莲花总皂甙溶液2 mL，对照组加入含同样浓度二甲基亚砜的 RPMI1640培养液2 mL。分别于培养24、48、72 h后提取各组细胞组织蛋白。参照试剂盒说明书进行操作。用Odyssey成像系统扫描各条带灰度值，并进行半定量测定，将β-actin条带作为内参照。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。计算Bax蛋白与Bcl-2蛋白相对表达量的比值(Bax/Bcl-2)。实验重复3次，取平均值。

2 结果

干预24、48、72 h，对照组各时间点Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；实验组各时间点Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；两组间各时间点Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 两组不同干预时间Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比较

3 讨论

SACC发病率约占涎腺癌的20%左右，可发生于任何年龄，以腭腺最为常见，大涎腺发病低但好发于颌下腺、舌下腺，无包膜，具有沿神经血管侵袭及肺转移的生物学特点。俞光岩等[2]分析显示，SACC淋巴结转移率仅2.1%、而远处转移率高达28.8%。目前治疗方式主要为手术切除，辅以化疗、放疗、生物治疗及中医中药治疗等。由于其易侵袭，与周围组织界限不清，手术中完整切除难度大，短期治疗效果较好，远期容易发生远处转移。据文献报道其远期生存率为37.4%～41.8%[3]。致死的主要原因多为远处转移，其中肺部转移占比最高。目前的化疗药物不良反应较大且临床疗效不甚理想。本研究的目的是为临床寻找有效、不良反应小、可长期应用的抗肿瘤药物。

研究证实，肿瘤的发生与癌基因的高表达及抑癌基因的低表达密切相关[4,5]。Bcl-2家族蛋白可以通过改变线粒体膜的通透性导致细胞凋亡，其机制为Bcl-2相关蛋白形成离子转运通道，引起线粒体膜的通透性改变，达到诱导细胞凋亡的目的。而Bcl-2家族两种蛋白的构成比例是细胞凋亡信号转导通路中引起细胞凋亡的关键因素，其中Bax/Bcl-2是启动凋亡过程的关键。Korsmeye等[6]提出Bcl-2/Bax是调控细胞凋亡的可变电阻器，在各种因素刺激下，细胞的生死直接取决于Bcl-2和Bax两种因子平衡的结果。王晶等[7]发现，美洲大蠊提取物可使Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱，从而降低线粒体膜电位抑制人肝癌细胞Bel-7402增殖。目前研究认为，当Bcl-2和Bax通过形成二聚体来调控细胞凋亡过程，二者形成异源二聚体时则能够抑制细胞凋亡。Mackey等[8]分析了前列腺癌肿瘤组织中Bcl-2、Bax表达水平及Bcl-2/Bax与放疗疗效的关系，结果显示Bcl-2/Bax升高是导致前列腺癌放疗失败的独立危险预后因素。李永生等[9]研究发现，粉防己碱抑制人膀胱癌BIU-87的生长与下调Bcl-2、Survivin和上调Bax、Capseae-3表达有关。目前研究发现，多数抗肿瘤药物通过诱导细胞凋亡达到治疗目的，这两种基因与肿瘤药物治疗的关系已成为抗肿瘤药物研究的热点之一[10]。

中药多被银莲花为毛莨科银莲花属植物，其干燥根茎又称为两头尖，药性辛、热、有毒，归脾经，具有消痈肿、祛风湿的功效，临床上常用来治疗四肢拘挛、痈肿溃烂、风寒湿痹、骨节疼痛等。研究发现，多被银莲花提取物有抗肿瘤、镇痛、抗氧化、抗惊厥、抑菌及抗迟发型超敏反应等作用[11～13]。张尔贤等[14]从中药多被银莲花中提取总皂苷(其中多被银莲花素A占20%)，测试总皂甙对小鼠肝癌H22、肉瘤S180和艾氏腹水癌EAC的抑瘤率以及体外对4种人癌细胞的抑制率，结果表明多被银莲花总皂甙具有明显的抑瘤作用。前期实验中ACC-M细胞经浓度为0、25、50、75 μg/mL多被银莲花总皂甙溶液干预72 h后，其凋亡率分别为21.11%、27.18%、30.6%、34.0%,表明多被银莲花总皂甙具有明显抑制ACC-M细胞增殖并诱导其凋亡的作用，但具体作用机制尚不明确。

本研究结果显示，在50 μg/mL多被银莲花总皂甙药物作用下,ACC-M细胞内Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低；且时间越长，以上变化越明显，Bax/Bcl-2逐渐增大。由此看来，多被银莲花总皂甙可下调ACC-M细胞Bcl-2基因的表达以及上调Bax基因表达，使得Bax/Bcl-2增大，从而诱导ACC-M细胞发生凋亡。对急性髓系白血病患者的Bax、Bcl-2表达水平与患者疾病缓解率、无病生存率关系的研究发现，Bax/Bcl-2对精确预测临床疗效有重要意义[15]。刘红等[16,17]分别在卵巢癌、宫颈癌的临床研究中得到类似结论。因此我们认为，多被银莲花总皂甙能够使ACC-M细胞内Bax/Bcl-2增大从而抑制ACC-M细胞活性并促进其凋亡。

综上所述，多被银莲花总皂甙可以诱导ACC-M细胞凋亡，其机制可能为上调促凋亡基因Bax的表达及下调抑凋亡基因Bcl-2的表达，使Bax/Bcl-2增加，导致线粒体外膜的通透性改变，进而引起ACC-M细胞凋亡。

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陈彦平(E-mail：cyp1962@126.com)

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R739.85

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1002-266X(2017)05-0033-03

2016-09-21)