牡荆苷对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织能量代谢的影响

颜娟，郑茂东，崔玉环，赵秀花，班旭霞，赵虹琇

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

·基础研究·

牡荆苷对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织能量代谢的影响

颜娟，郑茂东，崔玉环，赵秀花，班旭霞，赵虹琇

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

目的 探讨牡荆苷对小鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织能量代谢的影响。方法 将雄性昆明种小鼠60只随机均分为6组：假手术组、模型组、(10、20、40 mg/kg)牡荆苷组、尼莫地平组。采用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型。模型制备24 h，处死小鼠，取脑组织。用HPLC法检测脑组织三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)，计算能荷(EC)值；用相应试剂盒检测乳酸(LD)、乙酰胆碱酯酶(TchE)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP酶活力。结果 与模型组比较，尼莫地平组及10、20、40 mg/kg牡荆苷组ATP、ADP、AMP水平及EC值升高(P均<0.05)，TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力增加(P均<0.05)，LD活力降低(P<0.05)；10、20 mg/kg牡荆苷组以上指标与40 mg/kg牡荆苷组、尼莫地平组比较，P均<0.05，40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组比较，P均>0.05；牡荆苷三个剂量组之间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 牡荆苷能改善脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织的能量代谢，且该作用呈剂量依赖性。

脑缺血；再灌注损伤；牡荆苷；能量代谢；小鼠

脑缺血是临床常见的脑血管疾病之一，尤其脑缺血再灌注损伤是目前研究的热点。脑组织中血流中断以及再灌注引起脑组织细胞发生快速的级联反应，该反应由众多环节组成，如脑能量代谢障碍[1]、细胞内钙失稳态[2]、兴奋性氨基酸毒性[3]、细胞酸中毒[4]、炎症细胞因子损害[5]、自由基损伤[6]及凋亡基因激活[7]等。脑是能量代谢最活跃的器官，当脑血流供应中断，引起脑细胞损伤，其中脑神经最易受损，其功能与能量代谢密切相关。三磷酸腺苷(ATP)作为脑能量的主要来源，对维持细胞正常生理功能起重要作用。金莲花是毛茛科植物金莲花的干燥花及花蕾，有消肿明目、清热解毒的功效。牡荆苷是金莲花主要药效成分，属黄酮碳苷类化合物，具有抗氧化[8]、抗炎、抗病毒、抗癌、降压等作用。研究表明，牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织细胞膜的转运能力有保护作用[9]。2016年3～6月,本研究通过线拴法制备脑缺血再灌注小鼠模型，探讨牡荆苷对其脑组织能量代谢的作用。

1 材料与方法

1.1 动物及药品、试剂 昆明种雄性小鼠60只，体质量22～24 g，2月龄，由河北北方学院实验动物中心提供，合格证号：XCYK(冀)2010-2014。环境室温20～25 ℃，湿度50%～60%，自由饮水。牡荆苷(河北北方学院药物研究所)，纯度>98%；尼莫地平注射剂(河北医科大学制药厂)；乳酸(LD)测试盒、乙酰胆碱酯酶(TchE)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所提供)；ATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)标准对照品(天津一方有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 动物分组及脑缺血再灌注模型制备 将小鼠随机分为假手术组、模型组、(10、20、40 mg/kg)牡荆苷组、尼莫地平组，每组10只。按文献[10]采用线拴法制备小鼠脑缺血再灌注模型，于术后48 h阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态，5 min后恢复血液再灌注。假手术组术中仅暴露颈总动脉，并不进行插线。模型制备前牡荆苷组腹腔注射不同浓度(10、20、40 mg/kg)牡荆苷、尼莫地平组腹腔注射(0.6 mg/kg)尼莫地平，均连续3 d。模型制备再灌注24 h，小鼠称重，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉，仰卧位固定于手术台上，断头取脑，去除小脑和脑干。取脑缺血侧2/3脑组织，去除样本表面附属物，用5%高氯酸制成10%脑匀浆，4 ℃，4 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

1.3 脑组织ATP、ADP、AMP及TchE、LDH、LD、ATP酶活力检测 取脑组织上清液，加入碳酸钾溶液0.12 mL，调pH值为中性，4 ℃，3 000 r/min离心5 min，取上清液，HPLC法检测ATP、ADP、AMP[11]，计算能荷(EC)值。EC值=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)。取脑组织上清液，采用试剂盒检测LD、TchE、LDH、ATP酶(Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP)活力。

2 结果

2.1 各组脑组织能量代谢指标比较 与假手术组比较，模型组脑组织ATP、ADP、AMP水平及EC值降低(P均<0.05)；与模型组比较，尼莫地平组及10、20、40 mg/kg牡荆苷组ATP、ADP、AMP水平及EC值升高(P均<0.05)；与尼莫地平组比较，10、20 mg/kg牡荆苷组脑组织ATP、ADP、AMP水平及EC值降低(P均<0.05)，40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组相比差异无统计学意义(P均>0.05)；牡荆苷组三个剂量组之间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组脑组织能量代谢指标比较

注：与假手术组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05；与尼莫地平组比较,cP<0.05；与10 mg/kg牡荆苷组比较，dP<0.05；与20 mg/kg牡荆苷组比较，eP<0.05。

2.2 各组脑组织TchE、LDH、LD及ATP酶活力比较 与假手术组相比，模型组脑组织TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低(P均<0.05)，LD活力增加(P<0.05)；与模型组比较，10、20、40 mg/kg牡荆苷组TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力增加(P均<0.05)，LD活力降低(P均<0.05)。与尼莫地平组比较，10、20 mg/kg牡荆苷组TchE、LDH及Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低(P均<0.05)，LD活力增加(P均<0.05)，40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组相比差异无统计学意义(P均>0.05)；牡荆苷三个剂量组之间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

3 讨论

表2 各组脑组织TchE、LDH、LD及ATP酶活力比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与尼莫地平组比较，cP<0.05；与10 mg/kg牡荆苷组比较，dP<0.05；与20 mg/kg牡荆苷组比较，eP<0.05。

脑缺血后脑组织局部血流不足，导致大脑能量供不应求，临床主要表现为短暂性或者持久性神经功能损伤症状，对人体有很大的危害。研究表明，当脑组织血流完全阻断时，瞬间影响脑组织神经元代谢，接着脑电活动停止，进而破坏脑组织能量代谢及离子平衡，ATP大量耗竭。由于脑组织本身没有储备葡萄糖和氧气的能力，在脑损伤后糖酵解增强易产生酸中毒，引起脑组织水肿、细胞坏死。乳酸是糖酵解终产物，其浓度与缺氧程度呈正相关，与脑细胞内pH值相关，乳酸含量升高，引起pH值下降，导致脑胶质细胞不可逆损害，进而脑细胞膜上离子泵功能出现障碍，大量K+外流，大量Na+、Cl-和水内流进入脑细胞内，则脑神经元发生不可逆的损害[11]。脑能量代谢障碍直接反映脑神经功能缺陷，在脑缺血模型中脑部缺血严重导致LD增加，LDH以及TchE活力下降，细胞膜上ATP酶活性降低，ATP耗竭，脑细胞能量代谢严重受损，最终损害脑功能[12]。马霄等[13]研究表明，半枝莲总黄酮中剂量组可显著提高反复脑缺血再灌注小鼠脑TchE活力和LDH活力，明显降低小鼠脑LD水平。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组脑组织TchE、LDH活力降低，LD活力增加；牡荆苷组可显著增加脑组织中TchE、LDH活力，降低LD活力。10、20 mg/kg牡荆苷组对TchE、LDH、LD作用低于尼莫地平组；40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组相比无差异。

Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP是存在于生物膜上的一种蛋白酶，其生物学功能物包括能量转化、物质转运及信息转运，维持胞内外离子平衡，也是评价细胞膜功能的指标[14]。脑缺血再灌注损伤时，细胞氧化磷酸化能力减弱，ATP合成减少，能量消耗增多，Na+-K+泵功能受阻，Na+-K+-ATP酶活性降低，细胞膜对 Na+和K+的转运出现障碍。Na+和K+跨膜转运不足，激活电压依赖性钙通道(VDC)，引起大量Ca2+内流，同时脑损伤后可引兴奋性氨基酸囊泡大量破裂，释放神经递质，激活突触后膜的N-甲基-D-天冬氨酸受体，使VDC开放，引起大量Ca2+内流。Ca2+-Mg2+-ATP酶在维持细胞内Ca2+稳态过程中起重要作用。脑损伤时Ca2+-Mg2+-ATP酶活性也下降，Ca2+不能泵入内质网则在神经细胞内形成“钙超载”，诱发一系列病理损伤反应，加剧继发性脑损伤。另外膜去极化引起的过多Na+和Ca2+内流也是脑细胞水肿产生的主要原因，能量代谢不足和ATP酶功能障碍是脑损伤引起的细胞损伤的重要因素[15，16]。黎晓等[17]研究发现，染料木素磺酸钠能增加脑缺血再灌注损伤后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP活性，改善缺血区能量代谢，减轻脑水肿及“钙超载”。本实验结果显示，与假手术组比，模型组脑组织Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力降低显著；牡荆苷组可增加脑组织中Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Ca2+-ATP活力。10、20 mg/kg牡荆苷组对ATP酶活力作用低于尼莫地平组；40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组相比无统计学差异。

脑组织内能量在维持细胞内外离子平衡、物质运输、细胞膜完整性、信息传递、递质释放、合成代谢、摄取等方面起很大作用。当脑内血流供应受阻、能量耗竭时，运送到脑组织内葡萄糖和氧将减少，导致有氧氧化无法顺利进行，生成的ATP减少；而且脑组织中以糖原形式存在的能量很少，进一步引起ATP含量下降，与此同时ATP分解产物AMP、ADP增加后又相继分解，最终导致EC值明显下降。EC值反映高能磷酸键在ATP、AMP、ADP之间的相互转化，EC值可动态反映细胞能量平衡状态[18]。黄小平等[19]研究发现，黄芪甲苷和三七的主要有效成分配伍可显著增加脑缺血再灌注小鼠脑组织中ATP、ADP、AMP 的量和EC值。本实验结果显示，与假手术组相比，模型组脑组织ATP、ADP、AMP量以及EC值降低；牡荆苷组显著增加小鼠脑组织中ATP、ADP、AMP量以及EC值。10、20 mg/kg牡荆苷组对ATP、ADP、AMP水平及EC值的影响作用低于尼莫地平组；40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组相比无统计学差异。因此，牡荆苷对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤具有保护作用，该作用可能与改善细胞能量代谢有关。

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河北省医学科学研究重点课题(20150474)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.008

R743.31

A

1002-266X(2017)05-0026-04

2016-10-12)