Cullin-RING E3泛素连接酶及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展

韦琼，陈锦飞

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009；2.南京市第一医院，江苏 南京 210006)

·综 述·

Cullin-RING E3泛素连接酶及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展

韦琼1，陈锦飞2

(1.东南大学医学院，江苏 南京 210009；2.南京市第一医院，江苏 南京 210006)

Cullin-RING泛素连接酶(cullin-rING ligase，CRL)是人体内数量最多的一类泛素连接酶的统称，由cullin蛋白、RING蛋白及底物识别亚基组成。它们通过与数百种底物相互作用，形成数量庞大的CRL复合体并调控细胞内蛋白分子的泛素化降解过程。作者对CRL及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。

Cullin-RING泛素连接酶；泛素化；蛋白质降解；肿瘤治疗；CRL抑制剂；文献综述

泛素-蛋白酶体系统(Ubiqutin-proteasome system，UPS)是哺乳动物细胞内最主要的蛋白降解途径。靶蛋白的泛素化依赖胞内E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶的协同作用。目前发现，人体内含有两种E1泛素活化酶、大约38种E2泛素结合酶和数百种E3泛素连接酶，而E3泛素连接酶决定了底物的特异性。蛋白泛素化的最主要功能是为蛋白酶体提供识别和降解的信号。UPS功能众多，其功能失调被证实与肿瘤发生、发展及转移密切相关[1]。

Cullin-RING泛素连接酶(cullin-rING ligase，CRL)作为人体内最庞大的一类泛素连接酶家族，能够调节胞内众多肿瘤相关蛋白的泛素化修饰与降解[2]。作者先对CRL进行概述，然后进一步对CRL作为抗肿瘤治疗靶点的研究进展作一综述。

1 CRL的构成

蛋白在细胞内翻译后被泛素或一些其他类泛素分子共价修饰是一种常见的蛋白生理功能的调节机制，其中蛋白泛素化修饰最为普遍。E3泛素连接酶可以分为HECT结构域家族和RING-finger结构域家族两大类。CRL是RING-finger结构域家族的典型代表，属于人体内数量最大的泛素连接酶家族。CRL是一类由cullin、RING蛋白以及其他多种亚基蛋白共同组成的复合体[1]。其中，cullin蛋白作为支架蛋白通过羧基端结合RING蛋白构成CRL的催化中心，同时利用氨基端直接或间接连接底物识别亚基蛋白。迄今，在人体内已发现8种不同类型的cullin蛋白家族成员[3]，其蛋白均有保守的cullin同源结构域，可结合具有活性的亚基RING结构域蛋白。RING蛋白分为RBX1和RBX2两大亚类。人体内cullin蛋白、RING蛋白、接头蛋白和底物识别受体之间通过不同组合构成CRL复合体，胞内调控数以千计的蛋白分子的泛素化降解过程。

2 CRL活化的调控机制

CRL在细胞内的激活除了需要相关亚基蛋白的有效组合外，还依赖类泛素分子NEDD8对其Cullin骨架蛋白的共价修饰，即Neddylation修饰[1]。与蛋白泛素化修饰相似，蛋白Neddylation修饰也依赖自身通路的E1活化酶、E2结合酶以及E3连接酶介导的级联催化反应，将类泛素分子NEDD8共价结合到其下游底物蛋白[4]。Cullin蛋白通过Neddylation修饰促进CRL活化。除了Neddylation修饰通路外，哺乳动物细胞内还存在一种去除NEDD8修饰的CSN酶家族，最终能够负调控细胞内CRL的活性[5]。目前尚不清楚这两套酶系统是如何在不同生理或病理条件下通过协同或拮抗的方式来保证特定CRL对某一底物蛋白的有效降解。

3 CRL在肿瘤中的作用

CRL能够通过调节细胞周期相关蛋白、转录因子、信号转导分子、促癌蛋白、抑癌蛋白以及DNA复制相关蛋白等的降解，从而参与细胞周期、DNA 修复、信号传导、基因转录和胚胎发育等众多重要生物学过程的调控，其功能失调与细胞增殖失控、基因组非稳定以及恶性肿瘤关系密切。目前，部分CRL的组成蛋白已被确认是促癌基因(如SKP2等)，它们在肿瘤细胞内往往发生基因扩增或过量表达；虽然部分组成蛋白被发现具有抑癌作用(如FBXW7等)，但其在肿瘤细胞内多表现为突变。

3.1 Cullin蛋白

Cullin蛋白自身无生物学活性，其生物学功能依赖与其连接的底物识别亚基蛋白实现。目前临床研究发现：cullin-1蛋白主要在肺癌组织过度表达[6]，cullin-4A则在乳腺癌、肝癌和肾癌等多种类型的肿瘤组织呈现过度表达[7]。尽管cullin蛋白不是传统意义上的促癌蛋白或抑癌因子，但其过度表达也能够显著提升肿瘤细胞CRL的生物活性，进而促进肿瘤细胞的增殖。鉴于此，我们推测cullin-1蛋白和cullin-4A可能是有效的抗肿瘤治疗靶点。

3.2 RBX1和RBX2

RBX1和RBX2在多种类型的肿瘤组织中均高表达，通过RNA干扰技术或基因敲除的方法下调这两类蛋白表达的水平均能够抑制肿瘤细胞的生长。实验证实，这种抑制效应与肿瘤细胞发生凋亡和(或)衰老有关[8]。与此结果相对应的是，RBX2在肿瘤细胞内过度表达能够保护细胞免受外界应激所诱发的细胞凋亡[9]。这些研究结果表明，肿瘤细胞的生长与存活依赖于胞内RBX1和RBX2的表达。最近，我们通过动物模型研究发现，Rbx2基因被敲除后能够显著抑制肺部肿瘤的发展[10]，进一步证实了RBX2基因在肿瘤发展中的促进作用。由于RBX1或RBX2是构成CRL催化核心的关键蛋白，通过靶向RBX1或RBX2的策略能够抑制胞内大部分CRL的活性，因此具有潜在的广谱的抗肿瘤效果。

3.3 底物识别亚基蛋白(SRS)

在CRL复合物中，SRS主要起识别和招募底物蛋白的作用，但不同种类的cullin蛋白采用不同类型的SRS。迄今发现，人体至少编码69种不同SRS，其中SKP2和β-TrCP已经证明具有促癌功能。

3.3.1 SKP2 SKP2是SCFSKP2泛素连接酶复合体的底物识别亚基，能够介导多种细胞周期相关蛋白如p27、p21和 p57等的降解。大量研究证实，SKP2在胃癌、结肠癌以及白血病中高表达[11]，通过RNA干扰抑制SKP2的表达则能够抑制多种类型肿瘤细胞的生长[12]。对转基因小鼠模型研究发现，过度表达SKP2可以导致低程度的前列腺肿瘤和白血病的发生[13]。尽管SKP2基因敲除的小鼠没有产生显著的生物学表型，但在p53、PTEN或Rb等经典抑癌基因敲除驱动产生的肿瘤模型中，SKP2基因的缺失能够显著抑制或完全消除肿瘤的发生[14]。鉴于SKP2在肿瘤发生发展中的作用，美国的一个研究团队通过高通量筛选方法获得一个小分子化合物。该小分子化合物通过阻断SKP2蛋白与SCFSKP2泛素连接酶之间的连接而抑制SCFSKP2泛素连接酶的活性。利用该化合物处理肿瘤细胞能够导致SCFSKP2泛素连接酶底物p27发生积聚，进而诱导细胞发生周期G1期阻滞以及p27依赖的细胞杀伤作用。这些研究结果揭示了SKP2作为抗肿瘤治疗靶点的潜力。

3.3.2 β-TrCP β-TrCP是SCFβ-TrC泛素连接酶的底物识别亚基，包括β-TrCP1和β-TrCP2两种亚型。能够调控胞内众多重要蛋白包括促癌蛋白和抑癌因子的泛素化降解[15]。基于β-TrCP底物的多样性，β-TrCP到底是促癌因子还是抑癌因子往往取决于其所调节底物的性质。目前已证实，β-TrCP能够调节一系列抑癌蛋白，其在一些组织器官中具有明显的促癌作用，例如通过转基因小鼠模型过度表达β-TrCP1蛋白能够诱导乳腺、肠道、肝脏和肾脏肿瘤的发生。与β-TrCP1促乳腺癌作用一致，β-TrCP1在乳腺癌组织中过量表达，通过抑制β-TrCP1的表达能够显著提高乳腺癌和胰腺癌细胞对化疗的敏感性[16]，这些研究表明，β-TrCP具有作为肿瘤治疗靶点的潜力。

4 CRL是一种新兴的抗肿瘤治疗靶点

开展针对CRL肿瘤治疗的思路最初源于蛋白酶体的相关研究。美国Millennium制药公司开发的蛋白酶体抑制剂Bortezomib于2003年获准临床使用[17]。这一实例从临床实践层面证实了靶向泛素-蛋白酶体系统是安全而有效的抗肿瘤方法，同时预示着该系统内的其他关键酶也是潜在的靶点。最近Millennium制药公司采用阻断Neddylation通路的策略成功筛选了CRL的小分子抑制剂MLN4924。该化合物在本质上是NEDD8活化酶E1的直接抑制剂，它能够通过封闭NEDD8活化酶E1的活性位点并与NEDD8形成NEDD8-MLN4924复合物，导致NEDD8不能够修饰cullin蛋白，从而间接抑制下游CRL的活性。研究发现，小分子抑制剂MLN4924对结肠癌、肺癌、胰腺癌以及白血病等多种临床前模型均具有良好的抑制效果[18]。已经证实，MLN4924的抑瘤效应与其引起胞内CRL底物蛋白的积聚密切相关。目前，MLN4924作为抗癌新药正在美国接受人体Ⅰ/Ⅱ期临床试验，显示了良好的临床应用前景。

5 结论与展望

在提出CRL概念的近20年里，研究人员通过利用生物化学、遗传学、结构生物学等研究技术持续不断的努力，已经初步阐明了CRL的具体功能及调控机制，为今后进一步探索和开发针对性的抗肿瘤新药奠定了良好的基础。鉴于CRL仅仅是UPS的组成部分，选择性抑制CRL的肿瘤治疗策略比靶向整个UPS所产生的毒副作用明显降低。由于CRL参与调节多种与肿瘤细胞生长相关的信号通路，单纯抑制CRL可以起到同时抑制多种肿瘤相关信号通路的作用。这种治疗策略比传统的抑制单一信号通路的肿瘤治疗方法更为高效。目前成功筛选的CRL抑制剂MLN4924是Neddylation通路的NAE直接抑制物，显示出良好的应用前景。但最近有研究发现，肿瘤细胞经过MLN4924处理后可诱发部分细胞产生NAE点突变，这种诱发的突变能够显著降低MLN4924与NAE之间的亲和力，从而导致该类肿瘤细胞能够逃避MLN4924对Neddylation通路的抑制作用而呈现对MLN4924治疗的耐药性[19-20]。这一发现给今后临床开展针对CRL的靶向治疗提出了新的难题，同时也迫使我们去探寻新一代的CRL抑制剂，以克服MLN4924在未来临床使用中所诱发的耐药性。

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2016-08-08

2016-08-28

国家自然科学基金资助项目(81272469)

韦琼(1992-)，女，安徽芜湖人，在读硕士研究生。E-mail:1534602112@qq.com

陈锦飞 E-mail:Chenjinfei2016@163.com

韦琼，陈锦飞.Cullin-RINGE3泛素连接酶及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展[J].东南大学学报:医学版，2017，36(1)：120-122.

R34

A

1671-6264(2017)01-0120-03

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.031