保健食品中壮阳类西药成分的核磁共振氢谱定量分析

张志强，王丽娟，安东各，涂光忠，赵 阳

(1.北京微量化学研究所，北京 100091；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038)

保健食品中壮阳类西药成分的核磁共振氢谱定量分析

张志强1*，王丽娟1，安东各1，涂光忠1，赵 阳2

(1.北京微量化学研究所，北京 100091；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038)

建立了保健食品中枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非的核磁共振氢谱定量(1H qNMR)分析方法。采用布鲁克Avance DRX 500超导核磁共振波谱仪，以氘代二甲亚砜为溶剂，2,3,5-三碘苯甲酸为内标物，优化了仪器采集参数，并进行了方法验证。结果表明：当内标添加量为2 mg、内标与待测化合物摩尔比在1∶0.1～1∶1.2范围时，标准曲线线性良好，相关系数(r2)不小于0.999；枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非的检出限分别为0.045，0.026，0.033 mg/mL，定量下限分别为0.218，0.128，0.159 mg/mL；日内精密度RSD值分别为0.38%，0.85%，0.34%；日间精密度RSD值分别为0.72%，1.2%，1.4% 。利用所建立的方法对13种实际样品进行定量分析；并将测试结果与HPLC-DAD法测试结果进行比较，两种测试结果的RSD在1%～8%之间。

核磁共振氢谱定量；保健食品；枸橼酸西地那非；他达拉非；伐地那非

保健食品产销门槛低，利润高。不法商贩为了牟取高额利润，常在“补肾壮阳类”保健食品中添加大量的枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非等西药成分，以达到其宣称的“补肾壮阳”、“速效”、“持久”等功效。但大量摄入此类西药，会严重损害食用者身体健康，甚至造成死亡[1]。保健食品的非法添加现象已引起社会和政府的高度关注，相关部门也加大了对保健食品的管理和查处力度。

中药及保健食品中非法添加化学药品的检测方法主要有薄层色谱法[2]、液相色谱法[3]、液质联用法[4]、毛细管电泳法和毛细管电泳-质谱联用法[5-6]、气相色谱法和气质联用法[7-8]、近红外光谱法和傅立叶变换红外光谱法[9-10]、拉曼光谱法和表面增强拉曼光谱法[11-12]等。但随着检测设备的更新换代和样品多样化的扩展，社会对分析测试科学在检测手段和检测能力如时效性、准确性、可靠性等方面提出了更高要求。近年来，运用1H qNMR进行定量检测的研究逐年增多，Pauli等[13]对近90篇关于1H qNMR测定天然产物的文献进行了综述；张伟等[14]运用核磁共振法对8种生物胺盐酸盐标准物质候选物的纯度进行了定值；中国、美国和欧洲药典也收录了核磁共振定量方法的应用。

保健食品种类复杂、有机杂质含量高，传统的检测方法通常需要繁琐的分离、净化步骤，对检测方法的适应性具有较高要求。核磁共振氢谱定量(1H qNMR)分析技术以信号强度(谱峰的峰面积)与产生该信号的1H核数目成正比为理论依据，具有以下优点：样品制备环节少、质控性强、可多组分同时检测、同步实现定性和定量分析、受样液中色素等有机杂质干扰小、内标物选择范围广、特定物质有特定吸收峰可直接定性、样品可回收等。本文针对补肾壮阳及抗疲劳类保健食品中常见的枸橼酸西地那非、他达拉非和伐地那非成分建立了1H qNMR检测方法，并进行了方法学验证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

XS205DU电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；500 MHz超导核磁共振波谱仪(Avance DRX 500，瑞士Bruker公司)，配5 mm宽带多核(BBFO plus)探头)。

枸椽酸西地那非标准品(纯度98.8%)、他达拉非(纯度99.9%)、伐地那非标准品(纯度90.5%)均为European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare产品；2,3,5-三碘苯甲酸(纯度99.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)；二甲基亚砜DMSO-d6(氘代率99.9%，美国CIL公司)。

1.2 核磁测试溶液的配制

1.2.1 待测化合物母液 称取标准品枸橼酸西地那非66.64 mg、他达拉非39.16 mg、伐地那非48.81 mg，加DMSO-d6至10.349 89 g，配制成枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非浓度分别为6.44，3.78，4.72 mg/g的混合母液。

1.2.2 内标母液 称取2,3,5-三碘苯甲酸标准品100.46 mg于5.00 mL容量瓶中，用DMSO-d6溶解并定容，配制成0.020 09 g/mL的内标母液。

图1 枸橼酸西地那非(A)、伐地那非(B)、他达拉非(C)及三者混合物(D)的1H NMR谱图Fig.1 1H NMR spectra of sildenafil(A)，vardenafil(B) and tadalafil(C) and the mixture of them(D)

1.2.3 供试溶液 线性范围测试溶液：分别称量适量混标溶液并加入100 μL内标母液，加DMSO-d6至约0.60 mL，配制成内标与化合物的摩尔比分别为1∶0.1，1∶0.3，1∶0.5，1∶0.8，1∶0.95，1∶1，1∶1.2的系列标准溶液。样品试液的配制：选取代表性样品，粉碎、混匀后称取适量，加入100 μL内标母液，用0.66 mL DMSO-d6溶解，超声萃取10 min，以 9 000 r/min离心3 min，移取0.60 mL上清液至核磁管中待测。

1.3 核磁共振谱仪参数

谱宽为8 012 Hz，中心频率设置为3 250 Hz。脉冲宽度8 μs，扫描间隔时间20 s。

2 结果与讨论

2.1 待测化合物定量特征峰的选择

测试得到3种化合物及其混合物的氢谱(见图1)。3种化合物的化学位移主要分布在δ0～δ2，δ2～δ4.5，δ6～δ8，δ11～δ13，在实际检测中，δ2～δ6区域易受样品基质干扰，δ11～δ13区域为活泼氢信号，均不适合作定量特征峰。

枸橼酸西地那非和伐地那非在δ6～δ8区域和δ0～δ2区域，相近的峰互相重叠，所以当枸橼酸西地那非与伐地那非共存时，先用δ1.20～δ1.23处的三重峰(3H)对伐地那非进行定量，然后按比例由δ6～δ8区域的峰计算枸橼酸西地那非的含量。各化合物的定量峰选择如下：枸橼酸西地那非：δ7.816～δ7.870的峰组(2H)；伐地那非：δ7.92～δ7.97处的峰组(2H)；δ1.204～δ1.233处的三重峰(3H)；他达拉非：δ7.525～δ7.541处的二重峰(1H)。

2.2 内标化合物的选择

参考Torgny等[15]考察的25种内标物，本实验以2,3,5-三碘苯甲酸作为内标，以δ8.268～δ8.414(1H)的双峰作为其定量特征峰。该内标物不干扰待测物的测定，与待测物定量特征峰的化学环境相似，溶解性良好。

图2 伐地那非在不同脉宽下与内标峰面积之比随扫描间隔时间的变化关系Fig.2 Ratio of vardenafil's quantitative peak areas to internal standard in various pulse width conditions with relaxation delay values changes pulse width(1-4):30°，45°，60°，90°

2.3 扫描间隔时间和脉冲宽度的优化

分别测试了在30°，45°，60°，90°脉冲宽度下，待测化合物与内标定量特征峰面积的比值随扫描间隔时间(D1)改变发生的变化(见图2)。结果表明，90°脉冲宽度下，扫描间隔时间大于25 s时，待测化合物与内标峰面积的比值趋于稳定。

采用小角度的脉冲宽度可以更快地达到完全弛豫，有效缩短测试时长。但脉冲角度太小时，信号响应低，信噪比差，积分效果不稳定，误差较大。

综合以上因素，本实验选择60°脉冲宽度，即8 μs，扫描间隔时间设置为20 s。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 按“1.3”测试条件测定“1.2.3”所述线性范围测试溶液，以化合物与内标的摩尔比为横坐标，峰面积为纵坐标，得到3种化合物的线性方程为：枸橼酸西地那非：y=0.033 4x+0.071 6，r2=0.999 4；伐地那非 ：y=0.023 5x+0.033 0,r2=0.999 5；他达拉非：y=0.007 8x+0.033 3，r2=0.999 7。

2.4.2 检出限(LOD)与定量下限(LOQ) 实验发现，当内标与目标化合物的摩尔比为1∶0.01时，枸橼酸西地那非与伐地那非混合峰组(δ7.90)的信噪比为17.76，他达拉非(δ7.53)的信噪比为4.21，伐地那非(δ1.15)已接近噪音，此时扫描次数达到32次，测定时间约20 min，再增加扫描次数所得到信噪比的增长率降低，时间效益较低，因此认为此点为3种物质的检出限，即枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非的检出限分别为0.045，0.026，0.033 mg/mL。

当内标与目标化合物的摩尔比为1∶0.05时，枸橼酸西地那非与伐地那非混合峰组(δ7.90)的信噪比为55.48，他达拉非(δ7.53)的信噪比为13.64，伐地那非(δ1.15)的信噪比为40.84，可认为是此3种物质的定量下限，即枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非的定量下限分别为0.218，0.128，0.159 mg/mL。

2.4.3 仪器精密度与日内、日间精密度 对内标与目标化合物摩尔比1∶0.95标准溶液，用优化后的条件连续测试10次，以2,3,5-三碘苯甲酸δ8.32峰面积为1，记录各目标化合物定量峰面积，计算得到为橼酸西地那非、他达拉非及伐地那非的相对标准偏差(RSD)分别为0.16%，0.25%，0.45%。

选取内标与目标化合物的摩尔比1∶0.95标准溶液，用优化后的条件间隔4，8，12，24，48，72 h分别进行测定，记录化合物对内标的定量峰面积比，计算得到枸橼酸西地那非、他达拉非、伐地那非的日内RSD值分别为0.38%，0.85%，0.34%，日间RSD值分别为0.72%，1.2%，1.4% 。

本文对粉剂、丸剂、片剂、硬胶囊、软胶囊5种剂型共13个样品分别用HPLC法[16]与1H qNMR法进行了测试，结果见表1和图3。对同一样品通过两种方法得到的含量进行对比分析，RSD值在1%～8%之间，准确度符合方法比对的要求。由于取样量小(2～20 mg)、样品均匀度不够等原因，会导致测试存在误差，但偏差较小。

图3 软胶囊的HPLC谱图(A)及1H NMR谱图(B)Fig.3 HPLC chromatogram(A) and 1H NMR spectra(B) of soft capsule

TestNo．Sample1HqNMRresult(%)HPLCresult(%)RSD(%)VDSDTDVDSDTDSildenafilTadalafil1Powder10000 010 010 01--2Powder20000 010 010 01--3Powder30000 010 010 01--4Pill1015 0700 0113 990 015 3-5Pill200 0000 010 010 01--6Pill3028 0100 0127 280 011 9-7Tablet1021 7600 0120 960 002 6-8Tablet201 5900 061 410 018 3-9Tablet3021 8600 0222 190 011 0-10Capsule100000 040--11Capsule2098 5900 0190 170 016 3-12Capsule3071 4900 0169 510 012 0-13Softcapsule001 15001 24-5 3

*VD：vardenafil，SD：sildenafil，TD：tadalafil；“-” no data

3 结 论

本文以氘代二甲亚砜为溶剂，2,3,5-三碘苯甲酸为内标物，确定了定量检测枸橼酸西地那非、他达拉非和伐地那非的最佳分析条件。该方法检测枸橼酸西地那非、他达拉非和伐地那非的相关系数r2≥0.999，检出限分别为0.045，0.026，0.033 mg/mL，定量下限分别为0.218，0.128，0.159 mg/mL；目标化合物枸橼酸西地那非、他达拉非和伐地那非的日内精密度RSD值分别为0.38%，0.85%，0.34%，日间精密度RSD值分别为0.72%，1.2%，1.4% 。分别采用本方法与HPLC-DAD法测试相同样品，两种方法测定结果的RSD值在1%～8%之间，验证了1H qNMR法的准确性。本方法只有一步萃取环节，操作简单快速，结果准确可靠，可同时进行定性鉴别与定量测定，且无需待测物标准品，不会造成交叉污染，适用于食品或药品中非法添加物质的定性与定量检测。

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Determination of Anti-impotence Pharmaceutical Components in Dietary Supplements by1H qNMR

ZHANG Zhi-qiang1*，WANG Li-juan1，AN Dong-ge1，TU Guang-zhong1,ZHAO Yang2

(1.Beijing Institute of Microchemistry，Beijing 100091，China；2.Institute of Forensic Science，Ministry of Public Security P.R.C，Beijing 100038，China)

A method of1H qNMR was developed for the determination of sildenafil citrate，tadalafil and vardenafil added in dietary supplements illegally.In this experiment，Bruker Avance DRX 500 was applied，with deuterated dimethylsulfoxide(DMSO-d6) as solvent and 2,3,5-triiodobenzoic acid as internal standard substance.The spectral width，center frequency，pulse width，relaxation delay and the number of scans were optimized，and the method was validated.The results showed that,the correlation coefficients for the linear regression were not less than 0.999.The detection limits of the method for sildenafil citrate，tadalafil and vardenafil were 0.045，0.026，0.033 mg/mL，and the quantitation limits were 0.218，0.128，0.159 mg/mL，respectively.The inter-day RSDs were 0.38%，0.85%，0.34%，and the intra-day RSDs were 0.72%，1.2%，1.4%，respectively.The accuracy of the method was also verified by comparing the results of1H qNMR and HPLC-DAD，testing the same 13 samples.The results showed that the RSDs of two methods were between 1% and 8%.

1H qNMR；dietary supplements；sildenafil citrate；tadalafil；vardenafil

2016-09-07；

2016-09-30

北京市科技计划(Z151100001215006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.018

O482.532;TQ460.72 6

A

1004-4957(2017)02-0257-05

*通讯作者：张志强，硕士，研究方向：复杂体系的微量综合剖析，Tel：010-62887860-110，E-mail：zhang33_zzq@163.com