氨基酸-磷酸非共价复合物离子的电喷雾电离质谱研究

王奕允，任 娟，李树奇，孔祥蕾,2*

(1.南开大学 元素有机化学国家重点实验室，天津 300071;2.天津化学化工协同创新中心，天津 300071)

氨基酸-磷酸非共价复合物离子的电喷雾电离质谱研究

王奕允1，任 娟1，李树奇1，孔祥蕾1,2*

(1.南开大学 元素有机化学国家重点实验室，天津 300071;2.天津化学化工协同创新中心，天津 300071)

分子间的非共价相互作用对于理解分子复合物的结构和性质有着非常重要的意义。而电喷雾电离质谱(ESI-MS)是团簇化学研究的一种重要工具，广泛用于重要生物分子复合物的形成和性质研究，包括氨基酸、多肽和核糖等。该文将一定化学剂量比的磷酸分别与L型精氨酸和L型色氨酸混合，通过电喷雾电离的方法，利用傅立叶变换离子回旋共振质谱仪对精氨酸-磷酸以及色氨酸-磷酸的非共价复合物离子进行了研究。结果显示，精氨酸和色氨酸均可与磷酸分子产生种类丰富、价态为+1和+2的复合物离子。而对不同体系的生成离子分布进行分析，则显示出不同体系间的差别。

非共价复合物;电喷雾电离(ESI);精氨酸；色氨酸；磷酸

分子间相互作用是分子识别和组装的基础。因此,非共价复合物的检测、分析和相关研究近年来已成为被广泛关注的科学问题[1-12]。其中，软电离方法在一定条件下可使非共价复合物离子在气相中直接被检测,从而可得到与化学计量比、结合能等相关的分子复合物信息[1-3]。由于气相中生成非共价化合物，不受溶剂作用的影响，因此相关体系中的内在氢键、静电相互作用和疏水相互作用可以得到更加清楚的显示。作为一种非常重要的软电离方法，电喷雾电离(ESI)是研究分子相互作用的一种重要工具，近年来已被广泛用于重要生物分子复合物的形成和性质研究[1-12]。ESI在研究生物分子非共价相互作用的过程中，面临的一个重要问题是如何尽可能使非共价相互作用在离子化的过程中得以保留和最大程度上不被破坏。尽管当前学术界对此问题仍存在争议[1-2]，但被普遍接受的观点是：一方面，溶剂的组成、表面张力以及pH 值均会对分子间的相互作用有较大影响；另一方面，电喷雾电离过程中使用的实验参数(如电场强度、温度等)也会有所影响。为使实验中所获得的复合物离子更接近于其溶液状态，一般采用两种相对应的方法：①使电喷雾溶剂的条件尽可能接近于生理条件，以及尽量减少有机溶剂的比例，避免过低或过高的pH值；②尽量采用温和的ESI实验条件，如相对较低的加热温度，以及避免使用过高的电压等。

基于氨基酸分子在生物体系中的重要性，氨基酸分子与多种药物小分子、金属离子以及氨基酸分子本身之间的相互作用已被广泛研究[10-18]。如渠琛玲等[10]用电喷雾软电离技术研究了人参皂苷与多种氨基酸的非共价相互作用,并研究了这些非共价复合物的解离常数。储艳秋等[11]利用ESI质谱对谷胱甘肽和L型芳香性氨基酸形成的非共价复合物进行了细致的研究。申睿等[12]则利用电喷雾飞行时间质谱研究了氨基化环糊精多种氨基酸所形成的包络物，通过比较结合常数的大小,探讨了氨基化环糊精与氨基酸的作用方式。本课题组也对氨基酸分子本身形成的非共价复合物离子的结构和光谱进行了比较系统的研究[13-17]。

本课题组的前期研究表明，磷酸分子极易与丝氨酸分子形成种类繁多的非共价复合物离子[18]。随着复合物离子尺寸的变化，它们在碰撞辅助解离过程发生的解离通道也会发生变化。本文分别对精氨酸和色氨酸与磷酸分子在电喷雾电离过程中形成的复合物离子以及离子的分布进行了研究，从而为进一步理解磷酸分子在相关分子复合物的形成以及结构研究提供了基础。

1 实验部分

精氨酸(Arg)、色氨酸(Trp)纯度为99%，购于Sigma公司；甲醇(J.T.Baker公司)，乙酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)。首先配制20×10-3mol/L的精氨酸/色氨酸溶液与100×10-3mol/L的磷酸溶液，实验前将其分别稀释至1 mL的溶剂比为49∶49∶2的H2O∶MeOH∶CH3COOH混合溶液中，最终分别配成浓度为1×10-3mol/L精氨酸/色氨酸与5×10-3mol/L磷酸的混合溶液。

所有的质谱实验均在7.0T傅立叶变换离子回旋共振(FT ICR)质谱仪上进行(IonSpec,Varian,Lake Forest,CA,USA)。实验中所有离子均通过电喷雾电离(ESI)离子源产生。其中ESI源喷针的电压为3.6 kV。为使ESI电离过程比较温和，实验中源内加热温度设置为60 ℃，低于一般ESI实验中采用的80 ℃。样品溶液的流速为240 μL/h。ESI产生的离子经过不同的真空区域后，最终被引入到FT ICR分析池中进行检测。质谱检测均采用正离子模式,探测范围为：m/z200～2 500。

2 结果与讨论

2.1 精氨酸-磷酸复合物离子

图1A显示了磷酸与精氨酸混合溶液的电喷雾质谱图。从质谱图中可以看出混合溶液在电喷雾的过程中产生了多种丰富的复合物离子。其中丰度最高的离子峰来自于精氨酸三聚体Arg3H+(m/z523.333)。而在m/z为600～2 500内产生的大量离子可归属为精氨酸-磷酸复合团簇离子，其中丰度较高有[Arg4+(H3PO4)4+H1]1+(m/z1 089.360),[Arg4+(H3PO4)5+H1]1+(m/z1 187.337)和[Arg5+(H3PO4)6+H1]1+(m/z1 459.426)。借助FTICR质谱仪的高分辨和高精度的测量，95%以上的离子峰均可被精确地指认出来，均可表示为[Argm+(H3PO4)n+Hk]k+(简称RmPnHkk+)的结构形式。值得注意的是，一价复合物离子RmPnH11+与二价复合物离子R2mP2nH22+的单同位素峰具有相同的质荷比。例如,质荷比为1 187.337的峰，既可以认为是R4P5H11+的同位素峰，也可归为R8P10H22+的同位素峰。但利用离子的同位素分布和数据拟合可对其进行分析和确认。如图2所示,通过数据拟合可以确认实验中观察到的质荷比为1 187.337的峰实际上为R4P5H11+和R8P10H22+的混合峰，两者所占的比例分别为82%和18%。

通过对图1A中的数据进行仔细分析、比对和归属，可将所观察到的离子按照其电荷数进行分类。图3A和3B分别为其一价和二价复合物离子的分布图。对于一价复合物离子，根据其精氨酸分子数的不同，将其分为7个系列。整个谱图中存在R1-7PnH11+的信号，其中R4P1-8H11+,R5P1-9H11+与R6P1-12H11+三个系列具有较高的丰度。在不考虑精氨酸二聚体离子的情况下，这些系列的信号随着磷酸数目的增加呈现近高斯分布。其中丰度最高的离子峰依次为R4P5H11+,R5P6H11+与R6P7H11+。这表明当磷酸分子数比精氨酸分子数多1时，一价离子更稳定。对于二价复合物离子，谱图中可以看到7个系列的R8-14PnH22+(图3B)。其中各系列相应的最高峰依次为：R8P9H22+，R9P10H22+，R10P11H22+，R12P15H22+，R13P16H22+和R14P16H22+。值得注意的是，与之前报道的丝氨酸-磷酸复合物离子相比[18]，体系中产生的三价复合物离子信号非常弱，基本可以忽略。

图2 实验中观察到的m/z为1 187.337离子的峰图及其同位素分布(A)，离子R4P5H11+的理论计算质谱图(B)，离子R8P10H22+的理论计算质谱图(C)，混合离子R4P5H11+(82%)与R8P10H22+(18%)的模拟质谱图(D)Fig.2 Experimental isotopic distribution of the ions with the isotopic peak at m/z 1 187.337(A),and theoretical isotopic distributions of R4P5H11+(B),R8P10H22+(C) and a mixture of R4P5H11+(82%) and R8P10H22+(18%)(D)

2.2 色氨酸-磷酸复合物离子

图1B为色氨酸与磷酸混合溶液的电喷雾质谱图。与精氨酸类似，图中也显示出许多色氨酸与磷酸团簇离子的信号。丰度较高的是色氨酸与磷酸产生的团簇离子[Trp3+(H3PO4)12+H1]1+(m/z1 789.073)(简写为W3P12H11+),W3P13H11+(m/z1 887.053)等。与精氨酸体系相比，未观察到三价复合物离子。与精氨酸情况类似，其中一些离子峰是一价复合物离子WmPnH11+与二价复合物离子W2mP2nH22+的混合。例如:质荷比1 495.134的同位素峰，是W3P9Hkk+(73%)和W6P18Hkk+(17%)的混合。为了使整个质谱图更易读取，并便于分析和研究，对图1B中的复合物离子也进行了详细归类，其结果显示在图4中。图4A和B分别展示了一价和二价的色氨酸与磷酸形成的复合物离子。根据色氨酸分子数的不同，将一价复合物离子分为3个系列W2-4PnH11+，其中强度最高的离子峰依次为：W2P11H11+,W3P12H11+,W4P9H11+。对于二价复合物离子而言，谱图中可以看到5个系列的W2-6PnH22+，这些系列的信号随着磷酸数目的增多呈现近似的高斯分布，相应的最高峰依次为：W3P24H22+,W4P22H22+,W5P21H22+,W6P20H22+和W7P23H22+。

2.3 讨 论

图1的实验结果显示，与丝氨酸-磷酸混合溶液的质谱相似[18]，精氨酸和色氨酸与磷酸混合溶液在电喷雾电离的过程中，也能产生丰富的基于氨基酸和磷酸分子的复合物离子。这些离子主要为一价离子和二价离子。这一结果反映了磷酸分子非常容易与多种氨基酸分子形成种类丰富的分子复合物。这主要归因于磷酸分子在形成氢键的过程中，既可以给予质子，又可以成为质子的受体，因此极易与氨基酸分子或它本身形成复杂的氢键网络。

尽管如此，实验结果也反映了不同体系中存在一定的差别，主要体现在复合物离子的尺寸和组成分布上。对于一价复合物离子，丝氨酸-磷酸复合物离子中丰度较高的离子一般包含磷酸单元的数目约为丝氨酸单元数目的两倍[18]。而精氨酸-磷酸复合物离子中丰度较高的离子一般包含数目接近的精氨酸单元和磷酸单元。对于色氨酸，其包含的磷酸单元也较多。如对于包含4个氨基酸离子的一价复合物离子，对于丝氨酸、精氨酸和色氨酸，观察到相应系列中最高丰度的离子分别为S4P9H11+，R4P5H11+和W4P9H11+。对于二价复合物离子，丝氨酸-磷酸复合物中丰度较高的离子一般包含磷酸单元的数目较丝氨酸单元数目多4个，但不及两倍。而精氨酸-磷酸复合物中丰度较高的离子包含精氨酸单元和磷酸单元仍非常接近。但对于色氨酸，情况更不同，其包含的磷酸单元则远大于色氨酸单元的数目。另一方面，从总体上看，无论是一价或二价离子，所形成的复合物中包含的色氨酸数目明显少于丝氨酸和精氨酸。尽管实验中产生的复合物离子会受实验条件(如溶液条件、电离源参数)的影响，但考虑到以上实验均在一台设备上利用相同(或非常接近)的实验条件完成，因此结果仍具有较好的可比性。这些区别体现了不同氨基酸分子与磷酸分子相互作用时形成的氢键的差别，同时也反映出库仑相互作用也会对复合物结构产生影响，使得形成的复合物离子也与氨基酸分子本身的结构和极性密切相关。

上述研究结果显示了磷酸分子易于与精氨酸或色氨酸分子通过氢键网络构建形成种类丰富的分子复合物。尽管这些复合物的具体结构有待于进一步研究，但可以预测的是质子的转移在复合物的构建、分解和异构化过程中将占有非常重要的作用。而对于不同的氨基酸，其动力学过程也会有较大的区别。同时，当氨基酸分子与多个磷酸分子形成复杂的复合物时，其氨基和羧基端均与磷酸分子形成较强的氢键，在一定程度上会对氨基酸分子的活性和反应性有较大的影响。由于磷酸盐的缓冲液被广泛应用于生物分子的研究中，这些研究结果也可为相关条件下氨基酸分子的物理化学性质变化提供有价值的线索。

3 结 论

本文通过电喷雾电离的方法在傅立叶变换离子回旋共振质谱仪上得到了精氨酸/色氨酸与磷酸产生的复合物离子。实验发现，精氨酸/色氨酸与磷酸可以产生丰富的多价态复合物离子RmPnHkk+和WmPnHkk+，通过对不同价态复合物离子的分析，归纳出各自的分布规律。但对这些复合物离子的结构以及随尺寸变化可能引起的结构变化仍有待于进一步的研究。

[1] Loo J A.Int.J.Mass.Spectrom.,2000,200:175-186.

[2] Hofstadler S A,Sannes-Lowery K A.NatRevDrugDiscov.，2006,5:585-595.

[3] Zhang R P,Abliz Z.J.Instrum.Anal.(张瑞萍,再帕尔·阿不力孜.分析测试学报),2005,24(1):117-122.

[4] Liu Q,Zhang S Z,Wu B D,Shen R,Yun L H,Xie J W.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(刘勤,张淑珍,吴弼东,申睿,恽榴红,谢剑炜.质谱学报),2005,26(1):51-58.

[5] Li R,Ren H P,Sun Y T,Yao Y Y,Lu K,Ma L.Chin.J.Anal.Chem.(李锐,任海平,孙艳亭,姚英艳,卢奎,马丽.分析化学),2006,34(12):1801-1806.

[6] Cao Y,Han F M,Chen Y.ActaPharm.Sin.(曹燚,韩凤梅,陈勇.药学学报),2007,4:408-412.

[7] Wang Z F,Song F R,Liu Z Q,Liu S Y.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(王兆伏,宋凤瑞,刘志强,刘淑莹.质谱学报),2010,31(3):129-137.

[8] Hu W B,Wang F Y.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(胡文兵,汪福意.质谱学报),2010,31(6):354-361.

[9] Xu L S,Yang H M,Cui M,Song F R,Liu Z Q,Liu S Y.Chem.J.Chin.Univ.(徐牛生,杨洪梅,崔勐,宋凤瑞,刘志强,刘淑莹.高等学校化学学报),2012,11:2430-2434.

[10] Qu C L,Zhang H Q,Zhang H R,Bai Y P,Wen H.Chem.J.Chin.Univ.(渠琛玲,张寒琦,张华蓉,白雨萍,温慧.高等学校化学学报),2008,9:1721-1726.

[11] Chu Y Q,Dai Z Y,Jiang G Y,Zheng S B,Chen X,Ding C F.Chem.J.Chin.Univ.(储艳秋,戴兆云,蒋公羽,郑松柏,陈玺,丁传凡.高等学校化学学报),2009,5:869-875.

[12] Shen R,Wu B D,Liu Q,Gu M S,Xie J W.Chin.J.Anal.Chem.(申睿,吴弼东,刘勤,顾明松,谢剑炜.分析化学),2006,34(8):1153-1156.

[13] Kong X L.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.,2014,25:422-426.

[14] Liao G H,Yang Y J,Li S Q，Kong X L.Mod.Sci.Instrum.(廖冠华，杨一洁，李树奇，孔祥蕾.现代科学仪器),2014,156:29-32.

[15] Yin H,Kong X L.J.Am.Soc.MassSpectrom.,2015,26:1455-1461.

[16] Feng R X,Mu L,Yang S,Kong X L.Chin.Chem.Lett.,2016,27:593-596.

[17] Feng R X,Yin H,Kong X L.RapidCommun.MassSpectrom.,2016,30(S1):24-28.

[18] Kong X L.J.MassSpectrom.,2011,46:535-545.

Investigation of Noncovalent Complexions of Amino Acids and Phosphoric Acid by Electrospray Mass Spectrometry

WANG Yi-yun1,REN Juan1,LI Shu-qi1,KONG Xiang-lei1,2*

(1.State Key Laboratory and Institute of Elemento-Organic Chemistry,Nankai University,Tianjin 300071,China;2.Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin),Tianjin 300071,China)

Intermolecular noncovalent interaction is very important for understanding structures and properties of molecular complexes and clusters.Electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS) has demonstrated its powerful utility in the detection and research of weakly bound complex ions,including amino acids,peptides and proteins.In this paper,the noncovalent complex ions of arginine and tryptophan with phosphoric acid were investigated by ESI-MS method.The experiments were performed on a Fourier transform ion cyclotron resonance(FT ICR) mass spectrometer.The results showed that for both systems,wide varieties of noncovalent complex ions were generated and detected in the mass spectra.Most of these complex cations are singly or doubly charged,including both units of amino acid and phosphoric acid.The differences among different systems are also reflected by the distributions of the formed complex ions.

noncovalent complex;electrospray ionization(ESI);arginine;tryptophan;phosphoric acid

2016-10-04；

2016-11-15

国家自然科学基金项目(21475065)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.007

O657.63;O629.7

A

1004-4957(2017)02-0196-05

*通讯作者：孔祥蕾，博士，副研究员，研究方向：基于质谱和红光光谱的气相离子化学,Tel:022-23509564，E-mail:kongxianglei@nankai.edu.cn