扬州市乙型肝炎病毒的基因分型

唐 阳，曹 燕，杨立坤，肖越胜

(扬州市医学检验中心，江苏扬州225001)

扬州市乙型肝炎病毒的基因分型

唐 阳，曹 燕，杨立坤，肖越胜

(扬州市医学检验中心，江苏扬州225001)

目的研究分析扬州市乙型肝炎病毒基因型和病毒载量的关系。方法将278例乙肝患者按血清病毒拷贝数103-108等级分成6组，多重PCR(multiplex PCR，mPCR)分析基因型，按不同基因型在各组中的例数进行线性趋势χ2检验，分析病毒基因型在各组中比例随载量增加而出现的趋势改变。结果B基因型244例，C基因型60例，混合感染B+C基因型9例，线性趋势χ2检验存在统计学意义。结论扬州市乙型肝炎病毒感染以基因B和C型为主，未检测出A、D基因型，基因B型感染比例多于C型，随病毒载量的增高，基因B型百分比呈下降而C型呈上升趋势。

乙型肝炎病毒；基因型；线性趋势χ2检验

人乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是乙型肝炎（hepatitis B，HB）的病原体，属DNA病毒科，球形双层衣壳。HBV基因组是不完全闭合环状双链DNA，长度约3.2kb，有四个开放式阅读框（ORF），分别为S、C、P和X区，相互有重叠现象，具有转录和翻译蛋白的功能，其中S区编码大、中、小3种包膜蛋白。1972年根据HBV表面抗原的共同抗原决定簇将HBV分成四个血清型。1988年，Okamoto[1]等建立了以HBV全基因系列核苷酸异源性的分型标准，即根据S基因序列异源性大于或等于4%或全基因系列异源性大于或等于8%将HBV分为A-H 8种基因型[2]，最新研究发现HBV存在I和J基因型[3，4]。HBV基因型存在混合感染的现象[5]，有较为明显的地域分布，B型C型流行于亚洲，D型见于全世界。我国的HBV感染以B和C型为主，占90%以上[6-9]，南方以B基因型为主，C基因型主要分布于北方，A和D基因型在我国东部地区也有少量存在。HBV基因型不仅与病毒复制程度、肝细胞损伤、肝炎病程有关，而且直接影响到治疗过程、疗效等。研究HBV基因型对了解病毒感染后形成的不同临床表现，以及抗病毒药物的治疗效果具有重要的意义[10]。我国是HBV高感染HB高发病地区，文献报道我国大众人群HBsAg阳性率的修正数据为7.18%，以B和C基因型为主[11]。扬州市地处江苏中部，长江北岸，HBV流行较为严重，但HBV的主流基因型、病毒载量与基因型之间是否存在关系以及不同基因型混合感染情况未见报道。

1 材料与方法

1.1 样本来源样本来自本中心临床门诊2015年10月至2016年9月的乙肝病毒核酸定量（HBV DNA）检测的标本，血清采样管采血，3000r/min离心，按试剂盒说明书进行实时荧光定量检测。取典型的荧光扩增曲线，单位换算后大于1000copies/ml的样品共278份，－70℃冻存备用。

1.2 试剂和仪器HBV DNA荧光定量PCR：艾肯生物技术有限公司（杭州）；Viral Nucleic Acid Isolation Kit：硕世生物科技有限公司；S区A－D引物：上海生工生物有限公司；TaKaRa Ex Taq(Hot Start Version)：宝生物工程（大连）有限公司；ABI7500荧光定量PCR仪，美国ABI公司；普通PCR仪和电泳仪，美国BIO－RAD公司；GelDoc－It Imaging System，UVP公司。

1.3 研究方法将冻存血清室温融化后，3000r/min离心，根据实时荧光测定结果按103－108copies/ml分6组，按操作程序提取HBV DNA；对低病毒载量的标本，核酸提取时加大标本量，增加提取液中样本核酸含量和mPCR的阳性率。扩增后琼脂糖凝胶电泳成像判读HBV基因型。

1.4 多重引物PCR(multiplex PCR，mPCR)根据HBV的基因特性和地域特性，考虑满足本地病毒基因型种类的要求，研究采用的mPCR引物共四对（表1），分别为基因A－D型，引物位于HBV基因组的S区[12]。扩增体系25μl，扩增条件：95℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。

1.5 统计分析按HBV的病毒载量自然分层，即103～108分成6组，计算各组分基因B型和C型的百分数，采用同一基因型在各组中的例数分别进行B型和C型线性趋势χ2检验[13]，分析HBV不同基因型是否随着病毒载量的变化而出现比例上升或下降的趋势。

2 结果

2.1 将样本核酸进行HBV DNA S区片段mPCR扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度与目的基因片段长度对照确定基因型（图1、图2）。

2.2 样本经mPCR分析后，阳性结果253例，阳性检出率91.0%。其中HBV B基因型184例，占65.8%，C基因型60例，占21.6%，B型和C型混合感染9例，占3.2%，未检出A、D基因型。B基因型和C基因型在各组中例数进行线性趋势χ2检验，显示存在统计学意义，说明随着血液中HBV载量的升高，出现B基因型比例下降，C基因型比例上升的趋势（表2）。

表1 A-D基因型正反向引物核甘酸序列

表2 6组HBV基因型的检测结果

3 讨论

乙型肝炎病毒载量与病毒基因型之间关系的研究已很多，但运用线性趋势χ2检验研究HBV载量与一种基因型不同组别间比例关系还未见报道，本次研究发现随HBV载量的增加，B和C基因型间出现相反的变化趋势，存在统计学意义。基因B型在低载量组为主流基因型，在高病毒载量组中基因B和C型所占比例区别不大，经检验无统计学意义，说明基因C型在体内主要以强复制状态出现。由于病毒复制与肝细胞损伤有密切关联，目前主要观点认为，乙型肝炎的病理损伤是由于病毒复制过程中机体的免疫反应引起，病毒载量越高，所产生的免疫反应越强，引起肝损伤越严重。温先勇[14]从乙肝患者的自身免疫角度研究了免疫损伤的机制，发现HBV DNA载量与自身免疫间有某种关联。Lindh观点认为C基因型易产生核心基因启动子（BCP）的热点突变，产生严重的肝脏炎症、肝纤维化和进展性肝损害[15]。因此，感染基因C型HBV对肝的伤害较大。《慢性乙型肝炎防治指南》[16]指出HBV DNA大于105(copies/ml)要进行抗病毒治疗，且易产生严重肝脏疾病、进展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。随病毒载量增高，C型百分比越大，造成肝的危害越大。

线性趋势χ2检验是按自然顺序的等级分层或连续变量等级化后再分层的情况下分析率随该分层因素变化的趋势，较一般卡方检验比较各组率之间的差异具整体性，本实验是按HBV DNA拷贝数自然等级分层，检验后能观察到不同基因型在分层上率的变化趋势。

HBV基因型有地域分布差异，不同的基因在体内复制水平也不同。本研究B基因型72.7%，超过C型的23.7%，未检出A、D基因型，说明扬州市的HBV感染基因型谱较窄，符合中国南方HBV感染以基因B型为主的地域范围；B型和C型混合感染的比率3.6%低于其他研究；基因C型占比不高，但基因C型中的96.7%处于高拷贝组，应引起感染者和临床医生的重视。有9.0%样本未检出，不存在血清HBV DNA载量小的原因，可能是保存过程中标本受损、血清在服药后取得、或为非A-D基因型，有待进一步确定。

图1 mPCR凝胶电泳

图2 mPCR凝胶电泳

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The identification of hepatitis B virus genotypes in Yangzhou city

TANG Yang，CAO Yan，YANG Likun，XIAO Yuesheng.Yangzhou Center for Clinical Laboratory，Jiangsu Yangzhou 225001，China.

Objective To analyze the relationship between hepatitis B virus genotypes and the viral load in Yangzhou city. Methods 103-108ranks were divided into 6 groups according to the quantity of the grades of serum virus copy in 244 patients with hepatitis B from Yangzhou，Cochran Armitage trend test was carried out for multiple PCR(multiplex PCR，mPCR)according to the quantity of cases of different genotypes in each group and the trend of change was analyzed with the increased proportion of virus genotypes in each group increasing.Results The cases of genotype B were 244 in all samples and that of genotype C were 60，mixed genotype B and C were 9.Therefore Cochran Armitage trend test has statistical significance.Conclusion Hepatitis B virus infection are mainly B and C genotype in Yangzhou；A and D genotype are not tested；B genotype infection rates are higher than C genotype infection；with the increasing of viral load，percentage of B genotype is declining and C genotype is rise.

Hepatitis B Virus；Genotype；Cochran Armitage trend test

R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0036-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.010

2016-05-25；

2016-11-30)

江苏省中医药局科技项目。编号：LZ13199

唐阳，女，1988年生，本科，技师，专业方向：医学检验。

肖越胜，男，1965年生，主任技师，研究方向：疾病控制与微生物检验。Email：xys_109@163.com