高速逆流色谱分离纯化番泻叶中的苷类化合物

段文娟, 吴秋霞,, 李月,杨国红, 时新刚, 孙卫红, 王晓*

(1.山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2. 江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

【中药与天然活性产物】

高速逆流色谱分离纯化番泻叶中的苷类化合物

段文娟1, 吴秋霞1,2, 李月1,杨国红1, 时新刚1, 孙卫红2, 王晓1*

(1.山东省中药质量控制技术重点实验室，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2. 江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

采用高速逆流色谱法从中药番泻叶中快速分离得到4个苷类化合物，溶剂体系为正丁醇-水(9:10，V/V)，流速2.0 mL/min，检测波长280 nm，转速860 r/min。从200 mg番泻叶正丁醇萃取物中分离得到10 mg芹菜素-6, 8-二-C-葡萄糖苷、9 mg山奈酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷、15 mg异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷和5 mg番泻苷B，纯度分别为97.6%、98.9%、98.3%和99.3%。该方法稳定、高效，适合番泻叶中苷类化合物的分离纯化。

番泻叶；高速逆流色谱；苷类化合物；分离纯化

《中华人民共和国药典》2015年版一部中记载番泻叶为豆科植物狭叶番泻CassiaangustifoliaVahll或尖叶番泻CassiaacutifoliaDelile的“干燥小叶”[1]。番泻叶主要产于印度、埃及等地，我国所使用的番泻叶基本是从这些国家进口的，目前我国云南、广西等地也有引种栽培。番泻叶性味甘、苦、寒，其功能主要是泻热行滞、通便利水，用于热结积滞、便秘腹痛、水肿胀满。番泻叶是最早用作泻药和减肥药的植物之一。现代药理研究表明，番泻叶具有抗菌[2-4]、止血、消炎[5]、解痉[6]的作用。番泻叶化学成分的研究多采用传统硅胶柱色谱、大孔吸附树脂、高效制备液相[7-9]等，这些方法分离时间长，不但造成了试剂的浪费，而且由于分离过程中的死吸附导致样品大量损失。本研究采用高速逆流色谱技术(HSCCC)对番泻叶中的苷类成分进行分离纯化，解决了常规柱色谱分离过程中的死吸附和环境不友好等问题，从番泻叶的正丁醇萃取物中，一次分离得到芹菜素-6, 8-二-C-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷和番泻苷B等4个化合物。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

KQ3200型超声波清洗器(昆山超声仪器公司)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)；TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；TBP5002 泵(上海同田生物技术有限公司)；3057-11记录仪(重庆川仪总长有限公司)；8823B 紫外检测器(北京宾达英创科技有限公司)；Waters 600-996高效液相色谱系统(配有光电二极管阵列检测器(PDA)，美国Waters公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

实验用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等均为分析纯；高效液相色谱用甲醇为色谱纯(美国天地公司)，水为娃哈哈纯净水。

番泻叶药材购于山东省济南市漱玉平民大药房，经山东中医药大学李佳教授鉴定为豆科植物狭叶番泻的干燥小叶。

番泻苷B购自成都曼斯特生物科技有限公司， HPLC检测纯度大于等于98%。

1.2 粗提物的制备

称取番泻叶1.0 kg，粉碎机粉碎，无需过筛，倒入5 L的圆底烧瓶中，加入10倍量50%乙醇，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，减压回收溶剂，得正丁醇萃取物50 g，用于进一步分离纯化。

1.3 分配系数KD的测定

取少量样品置于1.5 mL试管中，加入等量的上下相各0.5 mL，剧烈震荡0.5 min，使样品充分溶解，静置分层，取上下相各0.5 μL分别用高效液相色谱(HPLC)进行检测，上相峰面积为A1，下相峰面积为A2，分配系数KD=A1A2。

1.3 两相溶剂体系及样品溶液的制备

本实验中HSCCC所用的溶剂体系为正丁醇-水(9:10，V/V)，按比例将这两种溶剂分别置于2 L的分液漏斗中，振荡充分混合后，于室温静置分层。分别取上相作为固定相，下相作为流动相，使用前超声脱气10 min除去气泡待用。

称取番泻叶正丁醇萃取物200 mg，加入上述溶剂系统的上下相各5 mL，超声搅拌使样品完全溶解。

1.4 高速逆流色谱分离

将已超声脱气的上相以20 mL/min的流速泵入螺旋管中直至有上相流出，以保证固定相充满整个分离螺旋管，然后打开主机，使色谱仪螺旋管柱按顺时针的方向旋转，当转速达到860 r/min并稳定后，以1.8 mL/min的流速将下相泵入分离螺旋管中，待有下相流出时(即螺旋管中的上下相达到平衡时)，将样品溶液注入进样圈中，打开紫外检测仪和记录仪，检测波长设置为280 nm，手动收集馏分。

1.5 HPLC分析和结构鉴定

番泻叶正丁醇萃取物和HSCCC分离得到的馏分均用HPLC进行分析。分析条件为色谱柱：Intersil ODS-SP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)和水(B)梯度洗脱：20%～25% A(0～10 min)，25% A(10～20 min)，25%～100% (20～21 min)A，100%A(21～30 min)；流速1.0 mL/min；检测波长340 nm；柱温为室温；进样量10 μL。HSCCC分离后各组分的化学结构通过ESI-MS和NMR进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 HPLC条件的优化

本实验考察了乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水作为流动相时对番泻叶正丁醇萃取物中各组分的分离效果。结果显示当采用乙腈-0.1%醋酸水系进行梯度洗脱时，番泻叶正丁醇萃取物中的成分可以实现较好的分离，结果见图1。

a 正丁醇粗样; b 芹菜素-6,8-二-C-葡萄糖苷; c 山奈酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷；d 异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷； e 番泻苷B。图1 番泻叶正丁醇萃取物和分离得到苷类化合物 的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of n-butyl alcohol extracts and separated glycosidic compounds

2.2 HSCCC溶剂体系的优化

选择合适的溶剂体系是高速逆流色谱分离纯化成功的关键，可以通过测定目标化合物在两相溶剂中的分配系数(KD)来选择合适的溶剂体系，一般而言，比较合适的KD值范围是0.5～2.0[10]。本实验首先选用的是乙酸乙酯-甲醇-水体系，结果发现不论如何调节体系比例，目标化合物都集中在下相，KD<0.5，无法实现目标化合物的分离。尝试氯仿-甲醇-水体系、乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水体系，结果显示目标化合物均偏水相，KD<0.5，各组分很快被洗脱出来，难以实现分离。采用极性最大的溶剂体系正丁醇-水体系，调节体积比为9:10，目标化合物的KD值基本符合要求，该体系中各物质的KD值如表1。因此，本实验采用正丁醇-水(9:10)作为高速逆流色谱的溶剂体系，从200 mg番泻叶正丁醇萃取物中一次性分离得到10 mg芹菜素-6, 8-二-C-葡萄糖苷、9 mg山奈酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷、15 mg异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷和5 mg番泻苷B(化合物结构式见图2，高速逆流色谱分离图见图3)，采用HPLC分析纯度，分别为97.6%、98.9%、98.3%、99.3%，结果如图3所示。

表1 目标化合物在溶剂体系中的KD值

图2 番泻叶中苷类化合物的结构式Fig.2 Chemical structures of glycosidic compounds from Folium Sennae

图3 番泻叶正丁醇萃取物的高速逆流色谱图Fig.3 HSCCC chromatogram of n-butyl alcohol extracts from Folium Sennae

2.3 化合物结构鉴定

化合物1：黄色结晶，UVmax(MeOH)nm：217, 272, 340；ESI-MS,m/z: 595.3 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 6.82 (1H, s, H-3), 8.02 (2H,d,J=8.4 Hz, H-2′, H-6′), 6.88 (2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, H-5′), 5.05 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1″), 4.62 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1‴), 9.36 (1H, s, 4′-OH), 10.38 (1H, s, 7-OH), 13.72 (1H, s, 5-OH)。以上数据与文献[11]报道基本一致，该化合物鉴定为芹菜素-6-8-二-C-葡萄糖苷。

化合物2：黄色粉末，UVmax(MeOH)nm：258, 270, 360；ESI-MS,m/z: 609.1 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 6.16 (1H, brs, H-6), 6.37 (1H, brs, H-8), 8.02 (2H, d,J=8.0 Hz, H-2′, H-6′), 6.90 (2H, d,J=8.0 Hz, H-3′, H-5′), 5.04 (1H, d,J=6.8 Hz, H-1″), 4.04 (1H, d,J=7.6 Hz, H-1‴)。以上数据与文献[12]报道基本一致，该化合物鉴定为山奈酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷。

化合物3：黄色结晶，UVmax(MeOH)nm：270, 355；ESI-MS,m/z: 639.2 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 7.93 (2H, brs, H-2′, H-5′), 7.49 (1H, d,J=2.4 Hz, H-6′), 6.90 (1H，d，J=8.4 Hz, H-5′), 6.41 (1H，brs，H-8), 6.19 (1H，brs，H-6)，5.52 (1H, d,J=6.8 Hz, H-1‴), 5.04 (1H, d,J=5.6 Hz, H-1″),9.82 (1H, s, 4′-OH), 10.80 (1H, s, 7-OH), 12.56 (1H, s, 5-OH)。以上数据与文献[11]报道数据基本一致，因此，该化合物鉴定为异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷。

化合物4：黄色粉末，UVmax(MeOH)nm：255, 270, 360；ESI-MS,m/z: 861.2 [M-H]-该化合物与番泻苷B对照品的TLC和HPLC检测对照一致，鉴定此化合物为番泻苷B。

3 结论

本研究首次采用高速逆流色谱技术对番泻叶正丁醇萃取物进行分离纯化，一次分离得到4个纯度大于97%的苷类化合物。研究结果表明，高速逆流色谱分离技术能简便、快速、高效地分离纯化番泻叶中的化学成分，为番泻叶的进一步开发利用提供技术支撑。

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Separation and purification of glycosidic compounds from Folium Sennae by high-speed counter-current chromatography

Duan Wen-juan1, WU Qiu-xia1, 2, Li Yue1, Yang Guo-hong1,SHI Xin-gang1, Sun Wei-hong2, WANG Xiao1*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory for TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and test Center, Jinan 250014,China; 2. School of Food and Biology Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

∶Four glycosidic compounds were rapidly separated from then-butyl alcohol of Folium Sennae by high-speed countercurrent chromatography with the solvent system ofn-butanol-water (9:10,V/V). The flow rate is 2.0 mL/min, the detection wavelength is 280 nm, and the rotate speed rating is 860 r/min. Separated from then-butyl alcohol extracts (200 mg) of Folium Sennae, their structures were identified as apigenin-6, 8-di-C-glycoside (10 mg), kaempferol-3-O-β-Dgentiobioside (9 mg), isorhamnetin-3-O-β-Dgentiobioside (15 mg), and sennoside B (5 mg) with the purities were respectively 97.6%, 98.9%, 98.3%, and 99.3%. The results show that this method is simple and efficient, which is suitable for the separation and purification of glycosidic compounds from Folium Sennae.

∶Folium Sennae; high-speed counter-current chromatography; glycosidic compounds; separation and purification

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.003

2016-11-02

三院联合基金(ZR2016YL006)；山东省科学院先导项目；山东省泰山学者岗位

段文娟(1981—)，女，副研究员，研究方向为天然产物研究与开发。E-mail: duanwj4048@126.com

*通信作者,王晓(1971—)，男，博士，研究员，研究方向为天然产物研究与开发。 E-mail: wxjn1998@126.com

R284.2

A

1002-4026(2017)02-0015-05