酶调节剂对烟草氮代谢及其化学成分的影响

*

（1.河南农业大学，国家烟草栽培生理生化研究基地，烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；2.河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 467002；3.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000）

酶调节剂对烟草氮代谢及其化学成分的影响

李亚飞1，常栋2，孙军伟3，杨惠娟1，王景1，史宏志1*

（1.河南农业大学，国家烟草栽培生理生化研究基地，烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州 450002；2.河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 467002；3.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000）

为调控旺长期烟株氮代谢活动，解决大理地区烟叶成熟度差的问题，分别在旺长期和成熟期研究了不同酶调节剂对烟叶氮代谢关键酶活性及烟叶化学成分的影响。结果显示，在旺长期喷施钼酸铵7 d后，中部叶和上部叶NR活性分别提高了6.56%和17.57%，GS活性分别提高了22.17%和15.24%，蛋白质含量升高了6.00%和5.02%，氮代谢明显增强；在成熟期对生长过旺烟株喷施钨酸钠和草丁膦4 d后，烟叶氮代谢活动减弱，上部叶NR活性分别下降了8.55%和18.55%，GS活性分别下降了5.33%和11.58%%，烟叶总氮、烟碱和蛋白质含量均下降，糖碱比增大，对解决烟叶成熟度差和提高烟叶可用性有利。就调控烟叶氮代谢效果和烤后烟叶化学成分协调性而言，以旺长期喷施钼酸铵和成熟期喷施草丁膦最佳。

烟草；酶调节剂；氮代谢；化学成分

硝酸还原酶（NR）是氮素还原利用限速酶，谷氨酰胺合成酶是氮素同化利用关键酶，它们活性大小对烟草氮代谢均有重要影响[1]。钼是硝酸还原酶的重要组成成分，对烟株氮代谢具有重要作用[2-3]。张继利等[4]通过研究发现，喷施钼肥有利于提高中上等烟比例和增加烟叶产质量。钨与钼属于同族元素，存在竞争关系，对NR活性具有抑制作用[5]。杨荣等[5]研究发现，1.0 mmol/L钨酸钠抑制油菜根系NR活性效果最佳，会引起氮素吸收速率下降。草丁膦（PPT），又名草铵膦，在生产中可作为一种非选择性触杀除草剂[6]，作用原理是其能够使谷氨酰胺合成酶（GS）空间构型发生变化[7]，抑制其活性而降低氮代谢活动[8-10]。许东亚[11]通过研究不同草丁膦浓度对烟草成熟期氮代谢和烟叶质量的影响，得出以10 mg/L效果最佳，但未涉及其作用过程。

云南大理是烟叶生产的重要产区，普遍存在土壤黏性相对较重[12]，氮素供应滞后，且大田中后期气温偏低，易出现成熟度差，烟叶总氮、烟碱含量高和刺激性过强等问题[13-16]。烟农片面追求产量，在烟田大量施用化肥，导致此类现象加剧。本试验通过在旺长期对正常生长烟株和在成熟期对生长过旺烟株分别喷施酶调节剂，研究对烟株氮代谢关键酶活性的影响过程以及对烟叶主要化学成分的影响，旨在解释不同酶调节剂对烟叶氮代谢活动和烟叶成熟落黄的调控作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2014年5—9月在云南省大理州弥渡县红花大金元基地进行。供试品种：红花大金元。

旺长期试验在团棵后10 d（移栽后40 d）进行，对正常生长烟株喷施不同化学试剂，按照随机区组设计，共设置4个处理，分别为①0.5%钼酸铵，质量分数；②0.4%钨酸钠，质量分数；③有效成分：10 mg/L草丁膦，体积分数；④对照CK，喷施清水。酶调节剂使用以均匀喷洒整株叶片和无滴水为准，75 L/666.7 m2。每个处理200株，3次重复，每小区两侧各 1行为保护行。试验田土壤类型为水稻土，无前作，试验前2年内无施用钼肥和草丁膦，土壤养分碱解氮211.31 mg/kg，速效磷33.81 mg/kg，速效钾125.39 mg/kg，有机质39.56 g/kg，pH 6.34。氮代谢酶活性测定时间：在喷施当天、喷后2、7和14 d分别取各处理上部叶（倒4叶位，有效叶数18片/株）和中部叶（倒9叶位，有效叶数18片/株）新鲜样品，用于烟叶NR活性、GS活性和蛋白质含量测定。

成熟期试验在打顶后10 d进行。试验田选择在烟株长势整齐，中上部叶叶色浓绿，整株叶片未表现出成熟落黄迹象，且已在中心花开放时进行打顶的地块进行。试验处理和酶调节剂使用方法同上，每个处理200株，3次重复。氮代谢酶活性测定时间：在喷施当天，喷后4 d和10 d取各处理倒4叶位（有效叶数18片/株）新鲜样品，用于烟叶NR活性、GS活性和蛋白质含量测定。

钼酸铵和钨酸钠均为化学分析纯药品；草丁膦，浓度200 mg/L，由德国拜尔作物科技公司生产，喷施时与0.5‰ SilWet-77表面活性剂配施。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 烟叶氮代谢NR、GS活性 烟叶NR活性采用活体法测定[17]。烟叶GS活性采用D O′ Neal[18]等方法测定。

1.2.2 烟叶蛋白质含量 烟叶蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[17]测定。

1.2.3 烟叶化学成分测定 每个处理按照国标（GB2635—92）选取烤后烟叶C3F和B2F 1 kg，在烘箱45 ℃下烘干，磨碎后过60目筛子备用。总氮、总糖、还原糖、烟碱按照YC/T159～162—2002烟草及烟草制品化学成分连续流动法测定。所用仪器为德国BRAN+LUEBBE公司制造的AA3型流动分析仪。标准烟样由中国农业科学院烟草研究所提供。

1.2.4 数据分析 采用Excel和Origin 9.0软件制作图表，SPSS 20.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 不同处理对烟叶NR活性的影响

喷施钼酸铵后，烟叶硝酸还原酶活性持续升高，而喷施钨酸钠和草丁膦，烟叶硝酸还原酶活性均下降（图1、2）。在旺长期，喷施当天上部叶和中部叶硝酸还原酶活性分别为101.22和120.68 μg/(g·h)，喷施钼酸铵 2、7和 14 d后，上部叶分别升高了3.20%、17.57%和19.30%，中部叶分别升高了8.25%、6.56%和4.95%；喷施钨酸钠和草丁膦2、7和14 d后，上部叶分别下降了18.11%、12.15%，39.29%、30.01%和 33.58%、31.79%，中部叶分别下降了12.83%、9.98%，30.28%、19.01%和31.18%、23.33%。在成熟期喷施钼酸铵4和10 d后，上部叶硝酸还原酶活性分别升高了8.79%和23.07%，而喷施钨酸钠和草丁膦4和10 d后，上部叶硝酸还原酶活性分别下降了8.55%、18.53%和15.56%、18.03%。

图1 不同处理对烟叶NR活性的影响（a上部叶，b中部叶，旺长期喷施）Fig. 1 Effects of different treatments on nitrogen reductase activities in tobacco(a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

图2 不同处理对烟叶NR活性的影响（上部叶，成熟期喷施）Fig. 2 Effects of different treatments on nitrogen reductase activities of upper leaves(spraying in mature period)

2.2 不同处理对烟叶GS活性的影响

喷施钼酸铵后，叶片谷氨酰胺合成酶活性升高，而喷施钨酸钠和草丁膦后则出现下降变化，与硝酸还原酶活性变化规律一致（图3、4）。在旺长期喷施当天，上部叶和中部叶谷氨酰胺合成酶活性分别为0.173和0.170 μmol/(mg·h)；喷施钼酸铵2、7和14 d后，上部叶和中部叶分别升高了6.26%、15.24%、12.51%和14.10%、22.17%、20.48 %；而喷施钨酸钠和草丁膦 2、7和 14 d后，上部叶分别下降了6.39 %、22.90%，17.68 %、32.31%和20.24%、37.67%，中部叶分别下降了6.58%、13.76%，17.49%、27.88%和25.67%、33.59%。在成熟期喷施当天，上部叶谷氨酰胺合成酶活性为0.106 μmol/(mg·h)；喷施钼酸铵4和10 d后，叶片谷氨酰胺合成酶活性分别升高了19.28%和32.79%；喷施钨酸钠和草丁膦4和10 d后，叶片谷氨酰胺合成酶活性分别下降了5.33%、18.29%和18.79%、27.51%，以草丁膦处理抑制作用最佳。

图3 不同处理对烟叶GS活性的影响（a上部叶，b中部叶，旺长期喷施）Fig. 3 Effects of different treatments on glutamine synthetase activities in tobacco(a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

图4 不同处理对烟叶GS活性的影响（上部叶，成熟期喷施）Fig. 4 Effects of different treatments on glutamine synthetase activities of upper leaves (spraying in mature period)

2.3 不同处理对烟叶蛋白质含量的影响

在旺长期喷施当天，上部叶和中部叶蛋白质含量分别为209.31和188.53 mg/g；喷施钼酸铵后，叶片蛋白质含量升高（图5），而喷施钨酸钠和草丁膦2、7和14 d后，上部叶蛋白质含量分别下降了2.43%、5.03%，7.25%、10.50%和9.39%、11.44%，中部叶分别下降了8.04%、8.98%，13.20%、16.34%和15.82%、17.61%。在成熟期喷施当天，上部叶蛋白质含量为145.07 mg/g；喷施钼酸铵后，叶片蛋白质含量有升高趋势（图6）；喷施抑制剂钨酸钠和草丁膦4和10 d时，叶片蛋白质含量分别下降了5.51%、9.99%和10.74%、23.22%，以草丁膦处理抑制效果最佳。

2.4 不同处理烟叶物理特性比较

在成熟期，喷施钼酸铵、钨酸钠和草丁膦后，烟叶长度增加，长宽比增大，单叶重、叶质重和含梗率下降，但处理间差异多未达到显著或极显著水平（表1）。其中，不同处理间中部叶单叶重以钨酸钠和草丁膦处理最低，钼酸铵处理次之，对照最高，差异达到显著性水平；不同处理间上部叶叶质重以草丁膦处理最低，达到显著性差异，钼酸铵和钨酸钠处理次之，对照处理最高。

图5 不同处理对烟叶蛋白质含量的影响（a:上部叶，b:中部叶，旺长期喷施）Fig. 5 Effects of different treatments on protein content in tobacco (a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

图6 不同处理对烟叶蛋白质含量的影响（上部叶，成熟期喷施）Fig. 6 Effects of different treatments on protein content of upper leaves ( spraying in mature period)

表1 不同处理烟叶物理特性比较（成熟期喷施）Table 1 Comparison of physical properties of tobacco leaves of different treatments（spraying in mature period）

2.5 不同处理烟叶主要化学成分比较

由表2可知，不同处理烟叶含氮化合物含量存在不同，部分指标达到显著或极显著性差异。喷施钼酸铵后，烟叶总氮、烟碱和蛋白质含量有升高趋势，上部叶烟碱和蛋白质含量超出优质烟叶要求（烟碱1.5%～3.5%，蛋白质8%～10%）[19]；喷施钨酸钠和草丁膦后，烟叶总氮、烟碱和蛋白质均下降，含氮化合物含量以草丁膦处理最为适宜。

表2 不同处理烟叶含氮化合物含量比较Table 2 Comparison of different treatments on the nitriccompounds

由表3可知，不同处理烟叶碳水化合物含量存在不同，部分处理间差异达到显著或极显著水平。喷施钼酸铵后，上部叶烟叶总糖和还原糖含量增加，两糖比和糖碱比增大，但中部叶总糖和还原糖含量减少，糖碱比减小；喷施钨酸钠后，烟叶总糖和还原糖含量均下降，但两糖比增大；喷施草丁膦后，烟叶总糖和还原糖含量升高，糖碱比增大，化学成分协调性增强。

表3 不同处理烟叶碳水化合物含量比较Table 3 Comparison of different treatments on carbohydrate content in tobacco

3 讨 论

在旺长期，烟株干物质积累量占总量的 64%左右[19]，氮代谢旺盛有助于为优质烟叶形成提供丰富的物质基础。在旺长期喷施钼酸铵，烟叶NR和GS活性提高，烟叶蛋白质含量增加，推测是由于喷施钼肥提高了NR活性，硝酸盐还原产物增多，能够为 GS/GOGAT循环反应提供丰富的反应底物，进而促进GS酶活性，蛋白质含量升高，氮代谢增强，这对促进烟叶生长发育和干物质积累有利。

本试验中，钨酸钠对烟叶NR活性具有抑制作用，这与在水稻[20]、小白菜[21]、油菜[5]和枳[22]等作物研究结果一致。在成熟期喷施钨酸钠，烟叶烟碱、蛋白质、总糖和还原糖均呈现下降，且糖碱比增大，对提高烟叶可用性有利。推测一方面是由于对成熟期生长过旺烟株喷施钨酸钠后，烟叶氮代谢减弱；另一方面钨酸钠又有抑制脱落酸形成的作用[23]，可能引起烟叶物质消耗和降解转化阶段延长所致，这有待进一步研究确定。

在生产中，草丁膦常作为除草剂使用，具有高效，残留少，对环境影响小的特点[24]。本试验草丁膦使用量10 mg/L（0.01 kg/hm2）远低于生产上作为除草剂的用量（防除一年生杂草除草剂用量 0.40 kg/hm2，防除多年生杂草用量1.00～2.00 kg/hm2[12]），但对烟叶安全性评价有待研究。在喷施草丁膦后，烟叶NR和GS活性下降，推测是由于GS活性受到抑制后，引起NH4+积累[9]，再通过反馈调节降低NR活性；喷施草丁膦后，烟叶总氮、烟碱和蛋白质含量有所降低，总糖和还原糖含量升高，糖碱比增大，烟叶化学成分协调性增强，对提高烟叶品质有利。

4 结 论

旺长期喷施钼酸铵能够明显提高烟叶 NR和GS活性，增强烟叶氮代谢，有利于优质烟叶形成；成熟期喷施草丁膦能够抑制NR和GS活性，烟叶总氮、烟碱和蛋白质含量下降，含碳化合物升高，对促进烟叶及时成熟落黄和改善其可用性有利。因此，在旺长期喷施钼酸铵和成熟期喷施草丁膦有利于解决成熟期烟叶成熟度差问题。

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Effect of Enzyme Modulators on Nitrogen Metabolism and Chemical Components in Tobacco

LI Yafei1, CHANG Dong2, SUN Junwei3, YANG Huijuan1, WANG Jing1, SHI Hongzhi1*
(1. National Tobacco Cultivation and Physiology and Biochemistry Research Center/Key Laboratory for Tobacco Cultivation of Tobacco Industry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Pingdingshan Branch of Henan Province Tobacco Company, Pingdingshan, Henan 467002, China; 3. Dali Branch of Yunnan Provincial Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

The field experiments of spraying different enzyme modulators were carried out to enhance nitrogen metabolism during the fast growth stage with the purpose of solving the tobacco maturity problem in Dali area. To this end, activities of the key enzymes in nitrogen metabolism and chemical components of flue-cured tobacco were measured. The results showed that spraying ammonium molybdate could increase nitrogen metabolism and the basic materials in the formation of high quality tobacco. Seven days after spraying ammonium molybdate at the rapid growth stage, nitrate reductase (NR) activity, glutamine synthetase(GS) activity and protein content increased by 6.56%, 22.17%, 6.00% and 17.57%, 15.24%, 5.02% in middle and upper leaves, respectively. After spraying sodium tungstate and glufosinate at the maturity stage, nitrogen metabolism had been weakened with nitrate reductase (NR) activity and glutamine synthetase (GS) activity decreased by 8.55%, 18.55% and 5.33%, 11.58% in middle and upper leaves, respectively. Total nitrogen content, nicotine content, protein content decreased, while reducing sugar/nicotine ratio increased. The methods of spraying ammonium molybdate during the fast growth stage and spraying glufosinate during the mature period were effective in regulating nitrogen metabolism and chemical components of tobacco.

tobacco; enzyme modulators; nitrogen metabolism; chemical components

S572.01

1007-5119（2017）01-0029-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.005

云南省烟草公司科技项目“提升红大烟叶品质的深化技术研究及应用”（2013YN28）；烟草栽培重点实验室项目“烟草氮素高效吸收利用及氮代谢动态调控技术研究”（YCZP201601）

李亚飞（1985-），在读博士研究生，主要从事烟草栽培生理生化研究。E-mail：scitech14@163.com。*通信作者，E-mail：shihongzhi88@163.com

2016-06-27

2017-01-17