液质联用测定饲料中的沙丁胺醇莱克多巴胺和盐酸克伦特罗

邓艳芹　吴国顺　倪杨帆　刘铭　刘斌　李红萍

摘 要：本试验对沙丁胺醇、盐酸克伦特罗和莱克多巴胺3种β-兴奋剂在饲料中的提取方法及其检测的色谱条件、质谱条件进行了优化。样品经乙酸-甲醇提取，混合型阳离子交换SPE小柱净化后，采用HPLC-MS/MS检测分析。3种目标化合物的检出限为0.005 mg/kg，定量限为0.02 mg/kg。加标回收率为70.2%～118.1%，5次测定结果的相对标准偏差为7.6%～8.1%。本试验所建立的前处理方法和儀器分析方法，不仅节省了检测时间，同时获得较好的回收率和精密度，可用于饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克伦特罗残留的测定。

关键词：沙丁胺醇；莱克多巴胺；盐酸克伦特罗；液相色谱串联质谱；饲料

中图分类号：S816.17 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132090

盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺属于β-兴奋剂，常被非法用于肉用动物的养殖以提高瘦肉率，通过聚集在动物可食用组织中而对人的组织器官产生毒副作用。开展饲料及饲料添加剂的检测是从食品安全源头进行控制的有效手段，对相关检测方法的研究具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器为赛默飞TSQ quantum Access MAX液质联用；固相萃取柱（Agela公司，Cleanert PCX-SPE）。莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗标准品购自农业部环境保护科研监测所（100ug/ml），根据需要用2%（v/v）冰乙酸稀释至合适浓度。HPLC级甲醇和乙腈（J.T.Baker）。甲酸铵、氨水为分析纯，冰乙酸为优级纯，甲酸为色谱纯。用水符合GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》的规定。

1.2 样品前处理

按GB/T14699.1规定方法采样约1.5kg，以四分法缩减至200g。用橡皮锤对样品进行粉碎，过40目筛后充分混匀，装入磨口瓶中备用。称取配合饲料5g（浓缩饲料、添加剂预混合饲料1g），精确至0.0001g，置于250mL具塞三角瓶中，加入25mL甲醇- 0.1M冰乙酸（80：20，v/v）的提取液，盖紧塞子，振荡提取30 min，定性滤纸过滤。

取1mL提取液滤液于5mL试管中，置50℃水浴中以氮气吹至近干。同时将SPE柱固定于SPE减压净化系统上，依次用1mL甲醇和1mL去离子水对SPE柱活化平衡。向样品试管中加入1mL2%（v/v）冰乙酸，漩涡振荡后全部加到小柱上，控制过柱速度低于1mL/min（每分钟不超过20滴）。上样结束后，分别用1mL0.9%（v/v）盐酸和1mL甲醇淋洗SPE柱。加入1mL氨化甲醇（25%氨水：甲醇，1：10，v/v）对柱上的目标化合物进行洗脱，洗脱速度不超过1 mL/min。收集洗脱液后，氮气吹干，用1.00mL2%（v/v）冰乙酸充分溶解混匀，0.22um滤膜过滤后待分析。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：HaloTM C18 3.0×100mm，2.7um；柱温：20℃；流速：200uL/min；进样量：10uL；流动相：0.73%甲酸铵+0.1%甲酸水溶液（A），甲醇（B），梯度洗脱条件为：0.5min 98%A +2%B；1.5min 70%A +30%B；3min 60%A +40%B；3.5min 30%A +70%B；平衡7.5min。

1.3.2 质谱条件

电喷雾正离子模式，喷雾电压3500V，毛细管温度400℃，鞘气35 arb，辅助气5 arb，选择反应监测扫描模式（SRM）。3种化合物的选择反应监测母离子、子离子（碰撞能量）为：沙丁胺醇240、166（12）、222（7）；盐酸克伦特罗277、132（26）、203（15）、259（7）；莱克多巴胺302、121（24）、164（16）、284（12）。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

本试验先后比较了50mL离心管和250mL三角瓶振荡提取的效果，后者提取的效率较高，费时较少，不需要多次抽提、离心和定容，直接过滤后即可进行下步净化操作。这是因为在振荡时，三角瓶中提取溶剂和样品的接触面积较大，从而提高了提取效率，可以避免多次离心的操作，使整个提取过程节省了较多时间。

本试验对文献报道的2种提取液即磷酸-甲醇溶液和乙腈进行了比较（牛晋阳等，2010；刘彩云，2008；李拥军等，2011）。试验发现乙腈提取的杂质较少，但是回收率较低。采用磷酸-甲醇提取液时回收率较好，但是磷酸在提取过程中的残留不仅会对仪器的检测系统产生污染，同时还可能通过基质效应来影响检测方法的灵敏度和选择性。本试验采用乙酸代替磷酸，发现其提取效率较高，且避免了磷酸残留对仪器的不良影响，最终确定采用甲醇- 0.1M冰乙酸（80：20，v/v）作为提取液。

2.2 液相色谱及质谱条件优化

比较了乙腈和甲醇2种不同的有机相，经过反复实验确定采用甲醇-甲酸铵水溶液体系对检测响应值和效果没有不良影响，同时基于乙腈毒性较大且价格昂贵，综合考虑后选择甲醇-甲酸铵水溶液体系作为流动相。通过优化梯度洗脱条件，使3种化合物的出峰时间从7.55～13.77min缩短至5.04～8.30min，每个样品分析时间从25min缩短至15min，且峰型更佳（图略）。利用质谱扫描收集3种化合物的母离子和子离子信息，确定适合定量分析的特征离子对，并对离子源参数和碰撞、传输参数进行了优化，响应值较好。

2.3 方法灵敏度、精密度及回收率

在空白饲料中添加3种目标化合物，以各物质的特征离子色谱峰信噪比S/N>3为方法检出限，S/N>10为定量限。饲料样品中3种目标化合物的检出限为0.005mg/kg，定量限为0.02 mg/kg。在空白饲料中添加0.1mg/kg的3种目标化合物进行5次重复回收率试验，3种化合物的加标回收率在70.2%～118.1%之间，其相对标准偏差在7.6%～8.1%之间。

3 小结

本文对沙丁胺醇、盐酸克伦特罗和莱克多巴胺3种β-兴奋剂在饲料中的提取方法及其检测的色谱条件、质谱条件进行了优化。所建立的前处理方法节省了大量的样品前处理时间，且操作更为简便，回收率较高。通过色谱条件优化，不仅节省了检测时间，同时用廉价且毒性相对较小的甲醇流动相代替乙腈，对检测的结果影响不大。根据仪器的型号和性能对化合物的质谱分析条件进行优化，提高了3种化合物的检测灵敏度和精密度。

参考文献

[1]牛晋阳，庞宇，姚欣乐.液质法测定猪肉中十种β-兴奋剂残留[J].食品科学，2010，31（8）：241-244.

[2]刘彩云.UPLC/MS-MS测定饲料中的莱克多巴胺[J].饲料工业，2008，29（16）：60-62.

[3]李拥军，熊文明，何凤芹，等.高效液相色谱-串联质谱法

测定饲料中3种β-兴奋剂[J]. 广东农业科学，2011， 38（24）：

90-92.

[4]顾亮，丁磊.液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J].化学分析计量，2012，21（1）：37-39.

[5]珀金埃尔默仪器（上海）有限公司.利用液相色谱-质谱联用法同时测定饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克伦特罗[J].食品安全导刊，2011（5）：42-43.