夹心ELISA检测鹿粘膜病病毒的研究

孟日增　宋屿竹　王嘉祺　刘金华　石建平

摘 要：为探讨在鹿黏膜病诊断中，采用夹心ELISA检测方法后，取得的临床价值。选取某鹿场的160份粪样为研究对象，均进行夹心ELISA检测，抗体包被量100g/孔；包被液pH9.5CB；酶标抗体稀释度1：400倍。观察检测结果。本次总共有160头样品，有52例显示阳性，阳性率为32.5%。在检测鹿黏膜病毒时，应用了双抗体夹心ELISA检测法，有效的弥补了上述检测方法的缺点。研究表明，该检测方法操作方便、简单，具有较高的特异性、灵敏性。且操作安全、可靠。因此，值得在临床上大力推广。

关键词： 鹿黏膜；病毒； 夹心ELISA；研究

中图分类号：S858.25 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132073

鹿黏膜病处于一种鹿传染病，症状表现为顽固性、持续性腹泻。近年来，随着社会、经济的快速发展，我国鹿养殖规模不断扩大。本文的目的在于探讨在鹿黏膜病诊断中，采用夹心ELISA检测方法后，取得的临床价值。对160份鹿粪样进行检测。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究中，选取的材料包括这几种。MD高免血清、 MD免疫球蛋白提取；MD酶标抗体；MD阳性粪样；MD阴性粪样；160例被检鹿粪样。

1.2 方法

常规筛选，找出最佳的试验条件。包括：抗体包被量、酶标抗体稀释倍数、粪样与酶标抗体温度，以及封闭剂等；进行夹心ELISA抗体检测时，应用的程序为：抗体包被—洗板—封闭—加待检样品—加酶标抗体—显色—终止反应—判定结果[1]；进行特异性阻断试验。按照1：5MD的比例，混合高免血清与阴性血清，保持4℃。隔夜后，判断OD值的变化，以此来确定试验的特异性；取适量的阳性粪样与阴性粪样，重复试验3次；对比电镜与检查实验。取适量阳粪样、阴性粪样，给予2%的磷钨酸负染，观察结果，对比2种方法的符合率[2]。

1.3 统计学方法

将上述统计数据录入到SPSS19.0统计学软件中，其中计数资料采取率（%）表示，组间率对比采取x2检验或t检验；对比以P<0.05表示结果差异明显，具有统计学意义。

2 结果

2.1 双抗体夹心ELISA检测MDV抗原的最适条件

经过筛选后，得出的最佳条件为：抗体包被量100g/孔；包被液pH9.5CB；酶标抗体稀释度1：400倍。底物显色温度37℃，时间20min。

2.2 特异性阻断实验结果

MDV高免血清可阻断阳性粪样的显色反应，OD值下降幅度超过50%。反应具有特异性。

2.3 交叉试验结果

对冠状病毒粪样与轮状病毒进行试验，结果显示均不显色。呈阴性反应。

2.4 重复性试验结果

本次进行了3次重复试验，结果无显著差异，可以看出该实验方法具有较好的重复性。

2.5 与电镜对比检查试验结果

本组研究中，在26份ELISA阳性粪样中，有24份电镜检查MDV呈球状，且大小不一，在40～60nm之间。另外，在8份ELISA阴性样品中，不存在 MDV例子。

2.6 某地鹿场的鹿感染MDV检查结果

本次总共有160头样品，有52例显示阳性，阳性率为32.5%。

3 讨论

当前，在鹿粘膜病检查中包括多种方法。常见的有：病毒分离法、中和试验法、琼扩试验。具体来讲，应用病毒分离后，操作复杂，耗费时间多，从而减低了分离率。采用琼扩试验，具有操作简单、方便的优势，但是特异性差，检出率不高，经常造成漏診的现行。中和试验具有较高的准确性，安全可靠[3]。然而，要求采取双份血清，无法进行早期诊断。同时，该方法在应用的过程中，花费的时间多，且消耗大量人力，比较麻烦。除此之外，应用中和试验时，还要在实验室培养细胞，且对实验室的要求比较高。再加上昂贵的检测费用，很难扩大应用。特别是针对基础条件比较薄弱的基层医院来讲，实施的难度更大。在这种情况下，就会对本病的检测与净化造成障碍。

本组研究中，在检测鹿黏膜病毒时，应用了双抗体夹心ELISA检测法，有效的弥补了上述检测方法的缺点。研究表明，该检测方法操作方便、简单，具有较高的特异性、灵敏性。且操作安全、可靠。因此，值得在临床上大力推广。

参考文献

[1]屈月，葛俊伟，唐丽杰，等.猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹

心ELISA检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2013，16

（5）：364-368.

[2]杨俊兴，曹琛福，曾少灵，等.牛病毒性腹泻病毒双单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J].动物医学进展，2013，18（5）：11-16.