miR-204通过RAP1信号通路诱导多形性胶质母细胞瘤凋亡

王洪财，赵 虹

miR-204通过RAP1信号通路诱导多形性胶质母细胞瘤凋亡

王洪财，赵 虹*

目的 探讨多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)中miRNA-204差异表达，及其对GBM U87凋亡的影响及作用机制。方法 下载TCGA数据库level 3水平下的miRNA以及mRNA的表达谱数据，基于显著负向调控关系建立miRNA-mRNA调控网络。结合单因素和多因素COX风险回归模型以及K-M生存分析识别预后相关miRNA集合，且能显著区分GBM患者高低生存。利用生物信息学方法，挖掘GBM预后相关的调控子网，并通过miRNA负向调控的基因集合在KEGG通路中的映射，分析miRNA对GBM患者预后的影响。通过MTT、AO/EB对GBM细胞系U87生存率以及表型进行检测。Western blot检测凋亡相关蛋白以及MAPK信号通路相关蛋白的变化。结果 共识别30个GBM预后相关的miRNA，这些miRNA构成的集合能够将高生存和低生存的GBM患者区分成两类。共14个miRNA出现在负向调控网络中。其中7个预后miRNA经实验证实为GBM抑制子。其余7个预后miRNA中，我们识别2个重要的风险性miRNA，即miR-204和miR-210，二者的表达可能会改变下游通路的活性，从而影响GBM患者预后。miR-204能影响U87细胞增殖，使促凋亡蛋白Bax蛋白的表达升高、抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达下调，使RAP1蛋白表达升高。结论 MiR-204通过RAP1信号通路调节GBM U87的凋亡,这为微小RNA可成为临床GBM患者的有效治疗药物提供了实验依据。

微小RNA；共表达网络；GBM；凋亡

0 引言

胶质瘤是高发于中枢神经系统的一类肿瘤，在脑部肿瘤中病死率最高。胶质母细胞瘤患者的平均生存期只有12～15个月，间变型胶质瘤的平均生存期也只有2～5年[1]。目前，胶质瘤最常见的治疗方法为外科切除结合放疗、化疗，但该治疗手段对于患者的长期生存率并未见明显改善[2]。基于脑胶质瘤的高致死率及有效治疗手段的局限[3]，科研工作者针对于这种高致死性肿瘤的内在发病分子机制进行研究，期望能够找到一种更加安全、有效的治疗方法[4]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类长度约18～26 nt 的非编码单链小分子RNA[5]。目前的研究显示，miRNAs的异常表达与胶质瘤的形成密切相关[6-8]，有望成为诊断及治疗胶质瘤的新的标记物和治疗靶点，为胶质瘤的治疗提供了新的思路[9]。本文基于生物信息学方法，筛选出miR-204，并证明miR-204对胶质瘤细胞凋亡具有调控作用，揭示其机制,希望能通过此项研究揭示胶质瘤的新的潜在的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用材料 人GBM U87由哈尔滨医科大学附属第四医院神经外科王健馈赠,用DMEM F12 (含10%小牛血清) 培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养。抗Bcl-2、抗Bax以及ERK1/2，P38，JNK单克隆抗体(美国Cell Signaling)。

1.1.2 样本匹配的miRNA和mRNA表达数据 从TCGA数据库下载GBM level 3下的基因和miRNA表达数据。经样本匹配处理，miRNA和基因表达谱包含478例样本(肿瘤468例，正常10例)，涉及534个miRNA和17 814个基因。

1.1.3 GBM样本的生存数据 GBM样本的临床数据同样从TCGA数据库获取，其中包含患者的ID、生存时间及生存状态。

1.1.4 实验验证的癌症miRNA数据 从OncomiRDB数据库中提取有实验证实的GBM相关的miRNA，关键词：“glioblastoma”、“glioblastoma multiforme”、“glioblastoma stem cells”、“glioma”、“glioma CD133+ cancer stem cells”、“glioma stem-like cell”、“glioma stem cells”和“glioma-initiating cells”。结果有69个miRNA与GBM相关。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定U87细胞生长抑制率 将1×104/L的U87 细胞接种于96孔板中,贴壁培养24 h后,向培养细胞中加入miR-204,转染48 h。每组设定6个平行孔,并设定空白对照。在吸光度(A490)检测。

1.2.2 Western blot分析蛋白质的提取 PBS漂洗各组细胞2次，4 ℃、5 000 r/min离心10 min。收集细胞，加入裂解液80 μL(RIPA∶蛋白酶抑制剂=1∶100)，冰上超声(60 Hz)打碎，10 min/次，13 500 r/min离心15 min，吸上清。BCA法测蛋白浓度。80 μg总蛋白质浓度在8%～10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至NC膜，然后将膜置于5% 脱脂奶粉中室温封闭2 h后，PBS冲洗。加入Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)和RAP1(1∶500)4 ℃过夜。用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次15 min，然后用红外荧光标记二抗(1∶10 000)，对膜室温孵育1 h后，用PBS-T冲洗NC膜3次，每次10 min。利用Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜上蛋白进行检测。

1.2.3 miRNA-mRNA调控网络建立 对表达谱上的任意miRNA与基因，计算其皮尔森相关系数(PCC),并且随机扰动表达谱上的miRNA与基因的标签100次，重新计算PCC，最终识别出显著负相关miRNA-mRNA调控关系对。结果有4 476对miRNA-mRNA显著负相关(PCC<-0.4且P-value<0.01)，其中包含89个miRNA，1 685个基因，见图1。

图1 miRNA-mRNA调控网络

1.2.4 单因素和多因素COX风险回归分析 单因素COX比例风险回归模型用来评价单个miRNA的表达是否是影响GBM患者预后的独立风险因素。Log rankP-value<0.05为该风险因素具有统计学意义。若风险性比HR>1，该miRNA的表达是风险性因素，若HR<1，则是保护性因素。结果有10个保护性miRNA，20 个风险性miRNA，见表1。

多因素COX比例风险回归模型用来评价多个miRNA的表达联合对GBM患者预后的影响。结果这30个预后相关的miRNA产生的Log rankP-value=4.00×10-8，具有统计学意义。

1.2.5 K-M生存分析 K-M生存分析用来评价30个预后miRNA的表达是否能显著地区分GBM患者的高低生存率。结果具有统计学意义，P-value=7.94×10-6，见图2。

表1 对30个预后miRNA的单因素COX分析

图2 预后miRNA集合的K-M生存分析

1.2.6 识别预后miRNA调控的下游通路 将30个预后相关的miRNA映射到调控网络中，提取其一步邻居来建立预后子网。结果子网包含414对miRNA-mRNA，其中有14个miRNA和269个基因，见图3。其中7个miRNA已经有oncomiRDB数据证实是GBM相关的miRNA，对于剩余的7个未被证实的miRNA，利用子网里其负向调控的基因集合来进行KEGG通路映射。

图3 预后miRNA集合调控子网

2 结果

2.1 基于miRNA-mRNA互作网络下的miRNA筛选 首先构建miRNA-mRNA负向调控网络，将30个GBM预后相关的miRNA集合映射到网络中，提取其一步邻居来构建预后子网。子网里14个miRNA中有7个是已知的GBM抑制子。在无实验证实的风险miRNA中，miR-204(HR=2.85；P-value=0.004)调控的47个基因映射出了RAP1信号通路，如图4所示。miR-204下调的基因GF正好处于通路的起始位置，其表达能影响到通路的全局调控，即下游的细胞黏附、增殖、生存基因激活等，进一步影响GBM患者的预后。

miRNA-210(HR=2.55；P-value=0.011)负调控25个基因，映射出cAMP信号通路。基因GPCR作为cAMP信号通路的开关之一，其活性影响通路中心PKA的表达，进一步激发对下游细胞生存、增殖、细胞转移以及细胞死亡等功能的影响(如图5)，最终影响GBM患者的预后。

2.2 过表达miRNA-204对GBM U87细胞存活率的影响 将miRNA-204转染到U87细胞中作用48 h后，结果显示，与对照组相比，U87的生长受到抑制(P<0.05)，如图6A。同时AO/EB的结果显示，U87细胞发生凋亡(如图6B)。

2.3 过表达miRNA-204对GBM U87细胞凋亡通路的影响 为进一步验证miRNA-204是否通过RAP1信号通路诱导U87细胞凋亡，应用Westernblot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax，同时也检测 RAP1信号通路的相关蛋白的变化。结果显示，与Control组相比，miRNA-204作用48 h后，U87细胞中Bax蛋白表达显著上调(n=3,P<0.05)，而Bcl-2蛋白的表达显著下调(n=3,P<0.05)，见图7A。而RAP1蛋白表达与对照组相比明显下调(n=3,P<0.05)，见图7B。

图4 miR-204负调控RAP1信号通路

图5 miR-210负调控cAMP信号通路

3 讨论

miRNA是一些5′端带磷酸基团、3′端带羟基,长度不大于22个核苷酸的非编码调控RNA家族[10]。研究表明，人类超过1/3的基因都受miRNA的调控[11]。miRNA具有使细胞异常分化的能力,而细胞的异常分化是肿瘤形成的关键,因此，miRNA 的表达很可能意味着恶性肿瘤的发生[12]。在研究人类肿瘤的发生及转化的过程中,miRNA 基因发挥了重要作用。

本文通过生物信息学方法建立了miRNA显著负向调控的miRNA-mRNA互作网络，由89个miRNA和1 685个基因产生的包含有4 476对miRNA-mRNA负向调控关系(P-value<0.01)。共识别了30个GBM预后相关的miRNA，进一步将其映射到负向调控网络当中，最后富集出mir-204与mir-210。笔者认为这两个miRNA与GBM的发生发展有着较大的相关性，但有文献表明miRNA210已经参与GBM[13]。因此，本研究选择miR-204作为后续的研究对象。

图6 miR-204对于U87细胞活性的改变

图7 miR-204对Bax、Bcl-2(A)及RAP1(B)蛋白的影响(n=3)

为了验证miR-204是否通过RAP1信号通路参与了U87细胞的凋亡，本研究检测了Bcl-2、Bax的变化以及RAP1信号通路中相关蛋白的变化。结果显示，与对照组比较，过表达miR-204能够增加Bax/Bcl-2的比值[14-15]，而加入miR-204作用后，RAP1蛋白表达下调。表明miR-204通过抑制RAP1蛋白表达从而诱导U87细胞凋亡，从而为miRNA对GBM的治疗提供了理论依据，同时为临床GBM 的治疗提供了新的方法和思路。

[1]Roy S,Lahiri D,Maji T,et al.Recurrent Glioblastoma:where we stand.South Asian[J].J Cancer,2015,4(4):163-173.

[2]Sordillo LA,Sordillo PP,Helson L.Sphingosine kinase inhibitors as maintenance therapy of Glioblastoma after ceramide-induced response[J].Anticancer Res,2016,36(5):2085-2095.

[3]Brzozowska A,Torun A,Mazurkiewicz M.The impact of surgery on the efficacy of adjuvant therapy in glioblastoma multiforme[J].Adv Clin Exp Med,2015,24(2):279-287.

[4]Jue TR,McDonald KL.The challenges associated with molecular targeted therapies for glioblastoma[J].J Neurooncol,2016,127(3):427-434.

[5]Bhartiya D,Scaria V.Genomic variations in non-coding RNAs:structure,function and regulation[J].Genomics,2016,107(2-3):59-68.

[6]Nikaki A,Piperi C,Papavassiliou AG.Role of microRNAs in gliomagenesis:targeting miRNAs in glioblastoma multiforme therapy[J].Expert Opin Investig Drugs,2012,21(10):1475-1488.

[7]Chen L,Kang C.miRNA interventions serve as ′magic bullets′ in the reversal of glioblastoma hallmarks[J].Oncotarget,2015,6(36):38628-38642.

[8]Henriksen M,Johnsen KB,Andersen HH,et al.MicroRNA expression signatures determine prognosis and survival in glioblastoma multiforme--a systematic overview[J].Mol Neurobiol,2014,50(3):896-913.

[9]Tivnan A,McDonald KL.Current progress for the use of miRNAs in glioblastoma treatment[J].Mol Neurobiol,2013,48(3):757-768.

[10]Holley CL,Topkara VK.An introduction to small non-coding RNAs:miRNA and snoRNA[J].Cardiovasc Drugs Ther,2011,25(2):151-159.

[11]Sethupathy P,Corda B,Hatzigeorgiou AG.TarBase:a comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets[J].RNA,2006,12(2):192-197.

[12]Ling H,Krassnig L,Bullock MD,et al.MicroRNAs in testicular cancer diagnosis and prognosis[J].Urol Clin North Am,2016,43(1):127-134.

[13]Lee D,Sun S,Zhang XQ,et al.MicroRNA-210 and endoplasmic reticulum chaperones in the regulation of chemoresistance in glioblastoma[J].J Cancer,2015,6(3):227-232.

[14]江海波,葛瑞祥,钱冬喜,等.miRNA-204与肿瘤关系的研究进展[J].沈阳医学院学报,2016,18(6):479-482.

[15]Kuwano Y,Nishida K,Kajita K,et al.Transformer 2beta and miR-204 regulate apoptosis through competitive binding to 3′ UTR of BCL2 Mrna[J].Cell Death Differ,2015,22(5):815-825.

miRNA-204 induces apoptosis of glioblastoma multiforme by RAP1 signaling pathway

WANG Hong-cai,ZHAO Hong*

(Department of Neurology,the 4th Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150080,China)

Objective To explore the effects and mechanisms of dysregulated miRNA-204 on the apoptosis of GBM U87.Methods We downloaded miRNA and mRNA expression data at level 3 in TCGA database,and constructed a network based on the significant miRNA-mRNA negative regulatory relations.Through combining with single and multiple factor COX risk regression models and K-M survival analysis,we identified prognostic-related miRNA sets that could significantly distinguish survival levels of patients with GBM.Using bioinformatics methods,we explored the prognostic regulation of GBM.Finally,we analyzed the effects of miRNAs on patients′prognosis by mapping targeted gene set into KEGG pathway.The survival rate and phenotype of human GBM cell line U87 were detected by AO/EB and MTT.The expression of apoptosis-related proteins and the changes of MAPK signaling pathway related proteins were detected by Western blot.Results We identified 30 miRNA related to GBM prognosis,and these miRNA can be a collection which could divided these high survival and low survival of GBM patients into two classes.A total of 14 miRNA were in the negative regulation network.Among them 7 patients with prognosis miRNA were confirmed as a GBM inhibitor.In addition,we identified two important risk miRNA,miR-204 and miR-210,in the 7 unconfirmed prognostic miRNA,and the expression of the two might alter the activity of the downstream pathway,which affected the prognosis of patients with GBM.We found that miR-204 could affect the proliferation of U87 cells,increased expression of Pro apoptotic protein Bax protein,down-regulated expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 protein,and increased RAP1 protein expression.Conclusion MiR-204 affects the apoptosis of GBM U87 through regulating RAP1 signaling pathway.This may be an effective therapeutic drug for the treatment of patients with GBM.

miRNA;Co-expression network;GBM;Apoptosis[1]

2016-04-19

哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科，哈尔滨 150080

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201702003