嵌合抗原受体T细胞疗法的不良反应与治疗

胡冠华综述 曾慧敏 张乐萍审校

北京大学人民医院儿科 （北京 100044）

·文献综述·

嵌合抗原受体T细胞疗法的不良反应与治疗

胡冠华综述 曾慧敏 张乐萍审校

北京大学人民医院儿科 （北京 100044）

T细胞可以通过表达嵌合抗原受体（CAR）对肿瘤靶细胞进行识别和杀灭。CART细胞治疗在血液系统肿瘤中疗效显著，但是在实体瘤中疗效有限。然而CART细胞治疗也可引起预期或不能预期的不良反应，包括细胞因子释放综合征、神经系统毒性、脱靶效应和过敏反应。理论上的不良反应还包括克隆扩增继发插入癌变、移植物抗宿主病和靶抗原不能识别。减轻不良反应已成为这一新兴技术成功应用的关键。文章综述CART细胞治疗的不良反应，以及理论上存在的不良反应及应对策略。

嵌合抗原受体T细胞治疗； 不良反应； 肿瘤

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种新的细胞免疫治疗技术，它将抗原抗体的高亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，通过构建特异性嵌合抗原受体，经基因转导使T淋巴细胞表达这种嵌合抗原受体，特异性地识别靶抗原从而杀伤靶细胞。通过基因改造技术, 效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高, 并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。设计的免疫细胞精确的识别肿瘤靶点可以减少传统化疗药物的不良反应，T细胞输注产生的免疫介导的严重不良反应也已被认识。T细胞治疗带来的不良反应有可能是即刻的、延迟的、严重的，甚至延续至基因改造的T细胞寿命终结，预防和应对不良反应已成为这一新兴技术成功应用的关键。本文重点介绍已报道的CART细胞输注后引起的不良反应和理论上存在的不良反应及应对策略。

1 CART细胞治疗的不良反应

1.1 细胞因子释放综合征

到目前为止，CART细胞输注后最常见的不良反应为免疫激活的发生，即细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）[1]。第一代CART细胞因为缺乏共刺激因子，T细胞增殖不足，细胞因子产生过少，缺乏抗肿瘤反应[2]。研究者将CAR进行了改造，将传递第2信号的CD28或 41BB 分子的活性域整合到CAR中，在抗肿瘤的同时完成自身扩增，增加体内存活时间。但是这种CART细胞输注是把双刃剑，可引起致命性CRS[3]。

CRS是免疫激活导致的炎性细胞因子的释放，从轻度的CRS（全身症状和/或二级器官毒性）到严重的CRS（3级或以上器官毒性，需要临床干预，和/或可能威胁生命）[4]，临床表现为高热、乏力、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心功能不全、肾损害、肝衰竭、弥漫性血管内凝血等。引发CRS的直接因素是超生理水平的炎性细胞因子，因此应选择合适的循环细胞因子诊断和定量CRS的严重程度。但成本和技术本身的困难使得临床不能实时监测血清细胞因子水平，阻碍了预测CRS出现的临床应用。因IL-6升高导致肝细胞分泌C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）增多，可以作为CRS出现和严重程度的标志[5]。但是，考虑到感染期CRP水平也会升高，无法区分感染相关炎症和非感染性炎症。因此，现在也有学者根据之前处理T细胞治疗相关CRS的经验，提出了一套用于对CRS严重程度进行分级的5 级系统，并根据相应级别提供了各自的治疗选择，以使患者致命危险并发症的风险最小化，同时最大化CART治疗效果。

在应用抗CD19特异CART细胞治疗复发难治性B细胞急性淋巴细胞白血病报道中，严重CRS的发生率为19%～40%[6]，这种差异可能与临床判定标准不同、肿瘤负荷、基因多态性、嵌合抗体设计不同及输注细胞表型不同有关。CRS严重程度不能预测临床预后，即使不出现CRS的患者仍然存在抗肿瘤效应。从血液系统恶性肿瘤患者中的应用经验来看，大部分患者细胞输注后至少会出现轻度CRS症状，如发热。

1.2 神经系统不良反应

神经系统不良反应在接受CD19特异性T细胞治疗的患者中已有报道，包括精神错乱、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛、癫痫发作[7]。其发生的病理生理机制仍未知，在应用双特异性T细胞结合蛋白治疗患者中也有类似事件[8]。细胞因子水平升高与神经系统症状有关似乎是合理的解释，也有研究认为是CART细胞毒性对中枢神经系统的直接作用，但这些尚未被证实。在出现神经系统不良反应的患者中，目前的临床信息还不能说明脑脊液中基因工程T细胞的数量与中枢神经系统白血病症状是否具有相关性。同样除临床症状外，脑电图记录并没有可靠的证据证明癫痫发作。到目前为止，神经系统不良反应在大多数病例中是可逆的，目前尚不清楚这种不良反应是局限于CD19特异性T细胞还是其他肿瘤相关抗原也会存在。

1.3 脱靶现象

理想的靶抗原是仅存在于肿瘤细胞，为肿瘤细胞恶性克隆提供重要生存信号，不幸的是大部分CART细胞靶标与正常组织具有共同的抗原，CART细胞与非肿瘤组织靶抗原接触引起所谓的“脱靶现象（ontarget/off-tumor recognition）”不良反应。这种不良反应可以从轻微的单系别缺乏如B细胞再生障碍性贫血到严重的不良反应死亡，这种不良反应在很多器官中是可以预测的，如胃肠道、血液系统、呼吸系统。在12例接受抗碳酸酐酶X（anti-carbonic anhydrase，CAIX）CART细胞治疗的转移性肾细胞癌患者中观察到了不同程度的肝脏不良反应，分析发现是由于CAIX CART细胞攻击同样表达CAIX的胆管上皮细胞所导致[9,10]。接受癌胚抗原CART细胞治疗结肠癌患者，因为抗原也表达与正常结肠组织中，治疗后导致短暂但严重的大肠炎[11]。接受CD19特异性CART细胞治疗的患者，因为CD19也表达于正常B细胞而导致B细胞免疫缺失，需要间断输注混合免疫球蛋白预防感染并发症。在1例结肠癌合并肝和肺转移患者接受第三代原癌基因表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2）CART细胞治疗时，因输注大量HER-2 CART细胞后，识别并攻击表达HER2的正常肺细胞, 释放过量细胞因子, 引起“细胞因子风暴”，很快出现呼吸、循环等多器官功能障碍，于5天后死亡[12]。这也是迄今为止公布的最为严重的CART细胞相关的不良反应。不过，很有可能是因为输注了大剂量CART细胞（1×1010）所致。随后的研究显示，在没有预处理情况下输注低剂量HER2特异性CART细胞是安全的[13]。

为避免脱靶效应，研究者首先应该考虑的是肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）。但目前已知的TSA较少，除了少数CART试验针对前列腺特异性膜抗原（prostate-speci fi c membrane antigen，PSMA）和表皮生长因子受体Ⅲ（epidermal growth-factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ）等TSA外[14,15], 大多数针对重要组织不表达或相对可损耗组织表达的肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）。其中, 关于针对CD19、CD20和CD22为靶抗原的CART细胞治疗B细胞恶性肿瘤的研究最多，原因是即便损伤了成熟B细胞，也只是暂时、可恢复的，且缓解期血液肿瘤细胞数量级约为108～109，而1 cm实体肿瘤其肿瘤细胞数就有约1×109。由于实体肿瘤一般具有包膜，不利于 CART细胞的浸润，且其肿瘤细胞的多样性也要高于血液肿瘤，以及肿瘤附近还存在包括免疫抑制细胞（调节性T细胞，骨髓来源的抑制性细胞，M2型肿瘤相关巨噬细胞）、细胞因子（转化生长因子TGF-β，IL-10）和肿瘤细胞表面抑制T细胞功能的蛋白（B7-H家族，Fas配体）等共同构成了肿瘤免疫抑制微环境，上述原因均可能导致 CART 细胞免疫疗法对实体瘤的治疗效果不理想，也是CART细胞目前主要治疗血液系统疾病的又一重要原因。

1.4 过敏反应

目前临床试验应用的转基因T细胞含有抗原识别区域，大部分取自小鼠单克隆抗体。因此，CART细胞输注后因为外来蛋白的免疫原性会引起细胞和体液免疫反应。目前正在努力使表达蛋白人源化，以产生持久和强有力的临床抗肿瘤效果。更急性的不良反应是宿主识别输入的外来成分导致急性过敏反应。研究报道，1例患者多次间皮素特异CART细胞输注，在第3次输注时出现心肺衰竭。这个临床试验的设计本意是多次输注短暂CART细胞以减少脱靶效应，在出现心肺衰竭后检测到人抗鼠抗体、患者血清中胰蛋白酶升高，支持IgE介导的急性过敏反应的诊断[16]。细心观察、及时识别、及时治疗危及生命的并发症对接受基因改造T细胞治疗的患者非常重要。

1.5 插入突变

造血干细胞基因治疗X-连锁重症联合免疫缺陷病和慢性肉芽肿性疾病会在人类细胞中发生插入突变（insertional oncogenesis）已经被确认。大部分病例是逆转录病毒载体插入到LMO-2原癌基因附近，在不同T细胞中插入转基因仍然有恶性转化的风险，但是到目前为止没有报道基因改造T细胞输注后引起恶性转化[17]。需要注意的是，LMO-2原癌基因在T细胞中是沉默的，使得逆转录病毒不能整合到LMO-2原癌基因中。基因改造T细胞的使用已经有数十年之久，实践证明是安全的，没有发现载体诱导永生化，克隆扩增或整合位点附近基因富集。综上所述，转基因T细胞发生插入突变的可能性很小，但是研究者应该时刻保持警惕，在临床试验中严密监控。

1.6 移植物抗宿主病

肿瘤患者接受自体过继性免疫治疗及自身来源的肿瘤特异CART细胞治疗临床证明是有效的。在接受CD19特异CART细胞治疗的患者中，一部分病人已经接受了同种异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT），应该接受供者来源CART细胞，除了同种异体反应性风险，allo-HSCT后采集的CD19特异CART细胞输注没有引起移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）风险的报道。一项针对难治复发B淋巴细胞肿瘤患者的临床试验，allo-HSCT后应用供者CD19特异CART细胞进行治疗，患者未发生GVHD。但是在这项试验中，患者在接受供者淋巴细胞输注后不产生GVHD才能进行CART细胞输注[18]。目前尚不清楚这种筛选条件是否会减轻同种异体反应性。除了目前已证明的安全性，CART 疗法是一种个体化疗法，细胞制品仅适用于患者自身，耗费时间及经费。建立一种“现货供应”或“第三方”细胞平台是一种有吸引力的解决方案，可减少时间及治疗费用。目前有两种方案正在实施：CAR转染病毒特异细胞和内生T细胞受体沉默，可拓宽基因工程技术的适用性[19,20]。

1.7 识别交叉反应抗原

大部分CART细胞识别抗原是通过抗原特异性单克隆抗体单链可变区序列。临床证明某些与CART细胞相应的单克隆抗体是安全的，另外有些单克隆抗体的不良反应尚不能确定。单克隆抗体与相应CART细胞相关不良反应有不同之处，这一点HER2/neu抗体曲妥单抗可以得到证明，单克隆抗体的不良反应如心脏毒性，HER-2/neu特异性CART细胞则没有。除了靶抗原的识别，基因改造肿瘤特异性T细胞可能识别靶抗原以外的抗原。至目前为止，CART细胞治疗临床试验中尚无证据说明CART细胞识别靶抗原以外的交叉反应抗原。但是在应用高亲和力T细胞受体抗肿瘤睾丸抗原MAGE-A3治疗的2例患者中出现了致命的心脏毒性[21]，MAGE-A3是一种肿瘤特异性抗原，表达于肿瘤组织、睾丸或胎盘中，在心脏组织中并不表达[22]，但是氨基酸扫描发现，心脏收缩分泌的肌联蛋白与MAGE-A3 T细胞受体发生交叉反应导致心脏毒性，而临床前应用体外试验时肌联蛋白并没有分泌，因而没有发现肌联蛋白与MAGE-A3 T细胞受体的交叉反应。这个结果说明预测交叉反应抗原毒性特别是在抗原递呈细胞分化活跃的不同阶段非常困难。因此，当新的CART细胞治疗选择新的肿瘤相关抗原时需要仔细监控，及时识别每个潜在不良反应。

2 CART细胞不良反应治疗方案

2.1 爬坡式治疗方案

很多临床试验采用了剂量爬坡的治疗方法。在同一代次的治疗中, 把细胞剂量由小到大分散到几次回输中，并不断监测细胞毒性；或是应用第一或者第二代CAR没有观察到毒性后, 再开始下一代CART细胞的治疗, 防止可能诱发大规模不良反应，但具体疗效还需进一步探讨。

2.2 药物的免疫抑制

CRS一旦诊断就需要采取合适的治疗方案控制炎症因子扩张引起的临床症状，在避免发生致命性CRS的前提下最好不要影响免疫细胞的抗肿瘤效应。全身性应用皮质激素可以快速控制CRS症状而不影响初始抗肿瘤效应，但是长期（＞14天）大剂量应用皮质激素会影响抗肿瘤作用，应用细胞特异性单克隆抗体或淋巴细胞化疗（环磷酰胺）等替代免疫抑制在理论上是可行的，但目前还没有实用性报道。而IL-6受体抑制剂塔西单抗（tocilizumab）是经美国FDA批准的有效并且能立即控制CRS症状的单克隆抗体免疫球蛋白，塔西单抗的使用可以封闭IL-6受体，CRS症状包括发热和低血压几乎可以立刻好转，但封闭IL-6造成的神经系统后遗症目前尚未知。抑制其他细胞因子或伙伴受体是否能有效治疗CRS而不影响抗肿瘤效应目前仍不明确，有待于后续的研究及临床检验。虽然托珠单抗已经成功用于处理CART细胞相关CRS，但尤为关键的是需要寻找合适的生物标志物以及时监测及预防。

2.3 自杀基因

鉴于CART细胞治疗有大范围的可预期和不可预期的不良反应，“自杀基因”的引入可以选择性清除CART细胞，在CART技术的发展过程中可能成为重要的组成部分。有几种技术已有在临床前和临床成功应用的报道[23]。第一个进入临床试验评估的基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex viral thymidine kinase，HSV-TK）基因，该基因催化更昔洛韦磷酸化，竞争性抑制鸟嘌呤核苷结合进而导致DNA聚合和合成中断，表达该基因的CART细胞被选择性清除[24]。这种方法的限制性在于单纯疱疹病毒胸苷激酶表达的免疫原性使基因改造细胞受到排斥。其次，依赖于抑制基因复制作为细胞死亡的方法可能会延缓临床获益。此外，广泛使用的抗病毒药物更昔洛韦禁止在CART细胞治疗患者中应用会影响临床治疗。另一种方法是利用突变的胸苷酸激酶，该激酶磷酸化HIV前体药物3′-叠氮-3′-脱氧胸苷，导致基因改造细胞DNA链合成终止细胞死亡[25]，但是与单纯疱疹病毒胸苷激酶相比疗效稍差[26]。

选择性细胞清除还可以通过凋亡分子诱导Fas或caspase（ICasp9）二聚化，嵌合分子二聚化包含FK506结合蛋白，当暴露于惰性小分子时导致相互交联，进一步激活caspases下游途径，进而启动凋亡途径[27]。ICasp9改造供者T细胞输注给单倍体相合HSCT患者治疗GVHD已经被证实有效[28]，单剂量小分子二聚化药物（AP1903）在注射30分钟后即可消除90% ICasp9改造T细胞，起效迅速，无任何不良反应，可快速逆转GVHD，无复发。尽管有如此戏剧化的效果，在没有小分子二聚化药物存在的情况下也可能发生ICaspe9二聚化，这在体外转染的细胞系中可观察到，导致基底细胞凋亡[29]，限制了该技术的广泛应用。

2.4 消除基因

另一种诱导转基因细胞选择性消耗的方法是使一个插入基因部分表达。基因改造细胞可以编程表达一个已知的细胞表面抗原，如CD20或表皮生长因子受体（EGFR），输入相关单克隆抗体（抗EGFR的西妥昔单抗和抗CD20利妥昔单抗）触发细胞死亡，可以应用经FDA批准安全性较好且临床医师熟悉的单抗[30]。在细胞表面表达已知抗原，可以用于体外筛选及体内跟踪转基因细胞群。限制这种方法的因素是单克隆抗体本身的不良反应，如正常细胞表面可能也表达这种抗原及抗体清除细胞造成的抗体依赖的细胞不良反应。癌症患者大剂量化疗造成免疫系统失调，清除基因改造细胞能力有限，特别是在不良反应发生时。在一个各种临床前技术应用安全性的比较研究中，IC9系统、CD20和利妥昔单抗组合的方法最有可能应用于临床，起效更迅速，疗效更好。

2.5 靶向激活

在CAR的结构中设计控制T细胞激活强度及毒性的功能区域，将组合靶抗原与T细胞激活结合起来。如果肿瘤细胞表达两种非特异性抗原，而正常细胞表达其中一种抗原，正常细胞因为不能提供活化信号或共刺激信号而亲和力不足，不能激活T细胞，因此可以减轻脱靶效应[31]。另外一种策略，正常组织表达两种抗原，而肿瘤组织表达一种抗原，T细胞经过基因修饰同时表达识别抗原 A的CAR和识别抗原B的iCAR，当这种基因修饰的T细胞遇到表达抗原A和B的正常细胞，由于来自iCAR中的程序性死亡受体（PD-1）或细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）胞内区T细胞抑制信号会削减来自CAR的T细胞活化信号，导致这些基因修饰的T细胞不能被活化，进而无法攻击这些正常细胞，避免了“肿瘤之外的打靶反应”；而当这些基因修饰 T 细胞遇到仅表达抗原A的肿瘤细胞时，由于肿瘤细胞表面缺少i所识别的抗原B，导致iCAR中的 PD-1 或 CTLA-4 胞内区T细胞抑制信号无法转导，进而不能削减来自CAR的T细胞活化信号，基因修饰 T 细胞将被激活，并通过释放颗粒酶和穿孔素来摧毁肿瘤细胞。该策略的核心在于给高活性的CART细胞装上了“刹车”，其“刹车”功能是借助于iCAR结构中具有抑制T细胞活性的[32]。

CART细胞治疗技术进展迅猛, 在体外和临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤活性和持久性, 为过继性细胞免疫治疗提供了新的有效解决方案, 展示了巨大的应用潜力和发展前景，但关于其不良反应的研究尚在探索阶段， 如何保证发挥CART细胞生物有效性的同时减少其潜在危险性, 是实现基因联合细胞治疗恶性肿瘤需要解决的问题之一，需要更多的研究和关注。

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(本文编辑：蔡虹蔚)

Toxicity and management in chimeric antigen receptor T-cell therapy

Reviewer: HU Guanhua, Reviser: ZENG Huimin,

ZHANG Leping
(Department of Pediatrics, Peking University People’s Hospital , Beijing 100044, China)

T cells can be genetically modi fi ed to target tumors through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR). Most notably, CAR T cells have demonstrated its clinical ef fi cacy in hematologic malignancies with evident responses when targeting solid tumors. However, CAR T cells therapy also has the capacity to elicit expected and unexpected toxicities including cytokine release syndrome, neurologic toxicity, “on target/off tumor” recognition, and anaphylaxis. Theoretical toxicities include clonal expansion secondary to insertional oncogenesis, graft versus host disease, and off-target antigen recognition. Abrogating toxicity has become a critical step in the successful application of this emerging technology. To this end, we review the reported and theoretical toxicities of CAR T cells therapy and strategies to cope with it.

chimeric antigen receptor T-cell therapy; toxicity; tumor

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.015

2016-10-27)