血浆肾素活性测量的研究进展*

李瑾综述，陈宝荣，徐蓓审校

(1.遵义医学院，贵州遵义 563000；2.北京航天总医院检验科，北京 100076；3.中国计量科学研究院化学所，北京 100029)

·综述·

血浆肾素活性测量的研究进展*

李瑾1综述，陈宝荣2，徐蓓3审校

(1.遵义医学院，贵州遵义 563000；2.北京航天总医院检验科，北京 100076；3.中国计量科学研究院化学所，北京 100029)

血浆肾素活性(PRA)作为继发性高血压最重要的实验室筛查项目之一，对鉴别原发性与继发性醛固酮增多症有重要意义。为更好地开展PRA测量的标准化工作，给临床提供准确可比的检验结果，该文系统地阐述了肾素的理化特性与临床应用、各种测量方法的性能与优劣、测量标准化的现状与问题，指明了探寻PRA标准化的路径。

血浆；肾素；血管紧张素Ⅰ；测量；标准化

血浆肾素活性(plasma renin activity，PRA)、醛固酮(aldosterone，ALD)和血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ水平是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)失调所导致的代谢紊乱疾病辅助诊断及高血压分类的重要依据[1-2]。肾素作为RAAS中一系列激素链的激发物质，对机体的体液容量、电解质平衡、血压调节等起重要作用[3]。PRA检测目前作为继发性高血压的实验室筛查项目之一，是原发性和继发性高血压分型诊断的重要指标。肾素分子结构复杂、血中含量少，目前实验室多通过测量PRA来表示肾素含量，但PRA测量尚未标准化。因此，如何根据血浆肾素的特点，选择并建立合适的PRA测量方法，为临床提供准确可比的测量结果具有重要意义。

1 肾素的理化特性与临床应用

1898年，Tigerstedt和Bergman首先在兔肾脏提取物中发现了一种强升压物质，被命名为肾素[4]。肾素在人体内以无活性的肾素原、有活性的肾素原、肾素3种形式存在，其中后两种具有肾素活性，能催化血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)转化为AngⅠ。在体外，肾素原可以通过酸激活、酶激活、冷激活的方式转化成活性肾素[5]。肾素原是肾素的前体，与肾素的结构十分相似，呈低活性，较肾素多43个氨基酸。肾素原在酶作用下生成肾素，也被称为血管紧张素原酶。肾素由肾小球中入球小动脉上的近球细胞分泌，含340个氨基酸残基，相对分子质量约为40 000[6]，呈二叶体结构，每个叶上有1个天冬氨酰基活性部位。肾素的活性位点在2叶间的裂隙内，此裂隙能结合底物即AGT的7～8个氨基酸[7]。

肾素与Ang、ALD三者构成RAAS。当血压降低时，肾脏分泌肾素，肾素经肾静脉进入血液，催化由肝脏分泌于血液中的AGT转变成AngⅠ(10肽)，血液和肺组织中的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)使AngⅠ降解为AngⅡ(8肽)，后者可被氨基肽酶水解为AngⅢ(7肽)[6]。其中，AngⅡ能够有效收缩血管，使血压升高；也能刺激肾上腺皮质球状带分泌ALD和抗利尿激素，促进肾脏对水和钠离子的重吸收，增加体液容量，最终升高血压[8]。

肾素作为RAAS的重要组成部分，其活性检测对临床高血压病因筛查、高血压用药指导及循环系统疾病辅助诊断具有重要意义[3]。原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，PA)是因肾上腺皮质病变导致醛固酮分泌增多、肾素-血管紧张素(renin angiotensinsystem，RAS)系统受抑制，表现出以低PRA和高ALD水平为主要特征、伴(或不伴)低血钾为主要临床表现的综合征，是一种常见的继发性高血压，占全部高血压的5%～15%[9]。研究表明，用ALD与PRA的比值(ARR)筛查后，PA检出率提高了5～15倍[10]。《原发性醛固酮增多症的临床诊疗指南》[11]中明确建议将ARR作为PA首选筛查指标。宋爱羚等[12]研究了PRA、AngⅡ及ALD水平在不同病因高血压患者中的差异，表明PA患者较原发性高血压患者具有高ALD浓度、低PRA水平，而嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)患者则PRA水平升高。对伴低钠血症慢性心衰患者，具有原发性高血压遗传因素者检测PRA也具有临床意义[13-14]。此外，PRA的测定还可用于指导原发性高血压用药，研究发现低肾素群高血压患者利尿剂及钙拮抗剂降压效果好，高肾素群高血压患者使用ACE抑制剂、AngⅡ受体拮抗剂及β受体阻滞剂降压效果更佳[15]。

目前，PRA检测的基本原理是通过间接测定AngⅠ的生成量来反映，即指血浆中内源性肾素催化AGT产生AngⅠ的速率。

2 血浆肾素活性的实验室检测方法

20世纪60年代，Harber和Boyd等[16]首先提出用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)检测PRA，至今已发展出多个实验室测定PRA的方法[17-28]。目前，临床实验室常用的是RIA[16-18]和化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)[19-20]。此外，基于分子结构建立的特异性好、灵敏度高的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[21-22]、质谱分析法[23-29]也逐步开始用于PRA的研究与测量。

2.1 放射免疫分析法 20世纪60年代，RIA[16]测定PRA开始应用。1975年，Drayer改进RIA，在样本中加入ACE抑制剂，提高了灵敏度[17]。2012年，邵娇梅等[18]在RIA[16-17]基础上，用液体闪烁计数器检测PRA及ALD，使RIA测量性能得到很好提升，精密度可达6.18%～10.79%，AngⅠ、ALD回收率分别为87.61%～116.89%、82.98%～119.22%。尽管改良后RIA测量性能已显著优于原RIA[16]，但RIA法难于自动化、测量影响因素多和对环境的污染问题等限制了该方法的临床应用，将逐步被其他方法所取代。

2.2 化学发光免疫分析法 雷永富等[19]用CLIA检测PRA及ALD浓度，辅助诊断PA。2016年，杨超一等[20]提出建立CLIA测量人AngⅠ计算PRA，测量范围为0.1～7.8 μg·L-1·h-1，灵敏度0.024 3 μg·L-1·h-1，批内变异5.6%～8.7%，批间变异6.8%～10.4%，经方法学评价符合免疫分析的基本要求。该类方法市场已有商品试剂盒，测量简便易行、可自动化、无环境污染，是临床易于接受的方法，但测量性能还有待进一步评价。

2.3 高效液相色谱法 1982年，Klickstein等[21]首次将HPLC用于检测AngⅠ，并提出该法可用于PRA测定。1992年，Nakamura等[22]将HPLC与荧光法相结合，用含荧光残基的N-(2-pyridyl)glyeine代替AGT作为底物，用荧光HPLC探测处理后样品的荧光信号，批内变异系数小于6%，批间变异系数小于15%，与RIA相关性很好。但HPLC因测定费时、工作量大等缺点，尚未见临床应用报道。

2.4 质谱法 质谱技术近年逐步进入医学检验领域，并广泛用于血液或体液中氨基酸、肽、维生素、激素、血药浓度、微量元素等微量或痕量物质的测量[30-31]。1999年，Fredline等[13]率先用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术测定PRA。PRA检出限0.14 μg·L-1·h-1，样品回收率92.3%。2010年，Bystrom等[24]通过监测AngⅠ的体外降解程度间接测量PRA。2012年，Chappell等[25]用LC-MS/MS检测肾素作用生成的AngⅠ，得出PRA定量限为0.005 μg·L-1·h-1，加标回收率达93%，AngI萃取绝对回收率达60%。Carter等[26]用在线固相萃取LC-MS/MS测定PRA，线性范围0.12～1.75 nmol·L-1·h-1；并研究样本室温保存的稳定性，证明样本室温24 h内稳定。Owen等[27]用离线固相萃取LC-MS/MS测量PRA，同浓度样本变异系数低于Carter等[26]的方法；对PRA小于0.3 nmol·L-1·h-1的样本孵育不同时间，认为不需要对低肾素活性样本延长孵育时间，但该结论尚未见其他作者研究证实。2015年，Popp等[28]用免疫基质辅助激光解离电离技术(iMALDI)测定PRA；PRA线性范围0.04～5.3 ng·L-1·s-1；与LC-MS/MS法比较发现该法不仅样本用量少且能显著改善PRA的线性范围(R2≥0.98)。2016年，Van Der Gugten等[29]用离线固相萃取LC-MS/MS对PRA定量，线性范围0.11～10.0 μg·L-1·h-1，与Carter等[26]在线固相萃取方法相比降低了PRA检出限，扩大了测量的线性范围。

3 血浆肾素活性测量的标准化

由于肾素缺少国际公认的PRA测量的参考方法和参考物质，目前尚未实现标准化。各实验室测量设备、方法、条件、参考范围不尽相同，PRA测量结果缺乏可比性，这使临床医生在用PRA结果诊断疾病时困惑很大。贺冶冰等[32]曾探讨ARR测定方法，通过停用降压药、取固定体位、固定时间段采血、充分钠摄入以及低血钾者补钾等，得出ARR大致范围，认为ARR检测方法或条件标准化，将有助于临床医生依据其结果筛查PA。赖凤华等[33]用RIA与CLIA检测PRA和ALD，评价两种方法对PA的筛查效率，发现CLIA具有更高的灵敏度，但RIA特异性更好。一方面，因PRA测定的是体内有活性的肾素，所以测定过程中应避免肾素原激活成肾素的影响。对低浓度样本一般通过延长孵育时间，测定增加AngⅠ的生成量，但存在即使样本孵育时间延长且有肽酶抑制剂存在的情况下，AngⅠ仍能很快降解的情况[24]。另一方面，AGT浓度也会影响PRA的测定，在肝硬化、充血性心力衰竭等情况下，AGT水平下降，PRA降低，而雌激素能增加AGT水平使PRA升高[9]。除此之外，溶血反应、妊娠、pH、抑制剂、孵育时间、体位、空白底物、样本的收集与贮存都可能成为影响PRA准确测量的因素[26,34-36]。

质谱分析技术是理想的候选参考测量技术之一。国际上已用该技术建立了醛固酮、皮质醇等项目的参考方法[37]。尽管Fredline等[23]基于质谱技术建立了测量PRA的方法，但目前的测量性能还远不能满足国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)对参考方法测量性能的要求。2014年，临床实验室标准化协会(CLSI)又发布了C62-A文件[38]，旨在指导、规范LC-MS法的开发和应用。Van Der Gugten等[29]提出应按照文件C62-A及EP32-R要求评价并保证质谱方法测量结果的可比性及溯源性。文件对基于质谱技术建立的各测量方法的性能验证提出了明确而具体的要求，对质谱测量标准化及质谱技术的广泛应用发挥积极的推动作用。

目前，尽管临床急需标准化的人血浆肾素活性的测量结果，但限于血浆中肾素低含量、结构复杂、在机体内的复杂代谢和测量形式的差异等问题的局限性，研究文献仍很少，急需深入研究与探索。通过系统研究建立PRA参考测量程序、并在此基础上研制具有互换性的PRA标准物质，并用于临床实验室的常规测量系统是最终实现PRA各实验室测量结果准确可比的关键，也是实现PRA标准化的必由之路。

4 小结与展望

血浆中肾素活性对于维持正常血压起重要调节作用。由于PRA检测的原理、方法不同，目前各实验室仍无法向临床提供准确可比的测量结果，给临床高血压的诊断、鉴别诊断及合理治疗带来困扰。通过对肾素的理化特性、PRA实验室检测现状及临床应用需求的了解，选择并建立灵敏度高、特异性强、测量范围宽、可自动化并易于标准化的测量方法是实验室当务之急。质谱技术具有灵敏度高、特异性强、测量范围宽等优势，是理想的候选参考测量技术之一，但仍需系统研究并建立满足ISO 15193性能要求的测量方法。在此基础上若能将质谱技术的研究成果与各类自动化方法结合必将对改进人PRA测量结果的准确可比发挥积极的作用。

[1]罗立基,陈浩明.肾素、醛固酮的实验室检测及其临床意义[J].中国检验医学与临床,2001，2(4):188-189.

[2]赵连友.血浆肾素活性在高血压鉴别诊断中的应用[J].陕西医学杂志,1994，23(3):135-138.

[3]张仕清,丁尔乾,王敬良,等.血浆肾素活性测定的临床意义[J].南京医科大学学报,1981(2):65-68.

[4]Tigerstedt R, Bergman PQ. Niere und Kreislauf [J]. Skandinavisches Archiv Für Physiologie, 2012, 8(1): 223-271.

[5]罗洪,陈孟勤.无活性肾素[J].生理科学进展,1988(1):32-37.

[6]丁报春,李子瑜,肖伟文.肾素-血管紧张素系统[J].生理科学进展,1979(4):318-329.

[7]杨晓慧,卢新政.肾素原及其受体的研究进展[J].中国病理生理杂志,2010,26(2):405-408.

[8]杜乃立,杜瑞芝.肾素-血管紧张素系统的研究进展[J].心血管病学进展,2005,26(s1):43-45.

[9]鄞国书,张少玲,严励,等.原发性醛固酮增多症筛查中血浆醛固酮/肾素活性比值的影响因素[J].中华内分泌代谢杂志,2009,25(2):238-241.

[10]Fardella C, Mosso SC, Cortes P,etal. Primary hyperaldosteronism in essential hypertensives: prevalence, biochemical profile, and molecular biology[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85(85):1863-1867.

[11]Funder JW, Carey RM, Fardella C,etal. Case detection, diagnosis, and treatment of patients with primary aldosteronism: an endocrine society clinical practice guideline[J]. Eur J Endocrinol, 2009, 93(9):3266-3281.

[12]宋爱羚,曾正陪,童安莉,等.不同病因高血压患者血浆肾素活性、血管紧张素Ⅱ及醛固酮水平的差异[J].中华高血压杂志,2012,51(6):294-298.

[13]富路,葛海龙,李佳,等.慢性心力衰竭患者血钠水平与血浆肾素活性、抗利尿激素、脑利钠肽的关系[J].中华心血管病杂志,2006,34(9):781-783.

[14]公茂莲,张红叶.原发性高血压与血浆肾素活性及血管紧张素原遗传关系研究[J].中国循环杂志,1998(6):340-342.

[15]Laragh JH, Sealey JE. The plasma renin test reveals the contribution of body sodium-volume content (V) and renin-angiotensin (R) vasoconstriction to long-term blood pressure[J]. Am J Hypertens, 2011, 24(11):1164-1180.

[16]Boyd GW, Adamson AR, Fitz AE,etal. Radioimmunoassay determination of plasma-renin activity[J]. Lancet, 1969, 1(1):213-218.

[17]Drayer JI , Benraad TJ. The reliability of the measurement of plasma renin activity by radioimmunoassay[J]. Clin Chim Acta, 1975, 61(3):309-324.

[18]邵姣梅,汪道双,赵春霞,等.液体闪烁计数器检测血浆肾素活性及醛固酮[J].中华全科医学,2012,10(12):1937-1939.

[19]雷永富,李敏.化学发光法在原发性醛固酮增多症诊断中的应用研究[J].中国实验诊断学,2015,19(10):1780-1783.

[20]杨超一,冯婷婷,张雪峰,等.血管紧张素Ⅰ化学发光免疫分析方法的建立[J].中国免疫学杂志,2016,32(6):838-841.

[21]Klickstein LB, Wintroub BU.Separation of angiotensins and assay of angiotensin-generating enzymes by high-performance liquid chromatography[J]. Anal Biochem, 1982, 120(1):146-150.

[22]Nakamura-Imajo N, Satomura S, Matsuura S,etal. Renin assay using a fluorogenic substrate and high performance liquid chromatography[J]. Clin Chim Acta, 1992, 211(1-2):47-57.

[23]Fredline VF, Kovacs EM, Taylor PJ,etal. Measurement of plasma renin activity with use of HPLC-electrospray-tandem mass spectrometry[J]. Clin Chem, 1999, 45(5):659-664.

[24]Bystrom CE, Salameh W, Reitz R,etal. Plasma renin activity by LC-MS/MS: development of a prototypical clinical assay reveals a subpopulation of human plasma samples with substantial peptidase activity[J]. Clin Chem, 2010, 56(10):1561-1569.

[25]Chappell DL, Mcavoy T, Weiss B,etal. Development and validation of an ultra-sensitive method for the measurement of plasma renin activity in human plasma via LC-MS/MS[J]. Bioanalysis, 2012, 4(23):2843-2850.

[26]Carter S, Owen LJ, Kerstens MN,etal. A liquid chromatography tandem mass spectrometry assay for plasma renin activity using online solid-phase extraction[J]. Ann Clin Biochem, 2012, 49(6):570-579.

[27]Owen LJ, Adaway J, Morris K,etal. A widely applicable plasma renin activity assay by LC-MS/MS with offline solid phase extraction[J]. Ann Clin Biochem, 2014, 51(3):409-411.

[28]Popp R, Malmström D, Chambers AG,etal. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI)[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1854(6):547-558.

[29]Van Der Gugten JG, Holmes DT. Quantitation of Plasma Renin Activity in Plasma Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)[J]. Methods Mol Biol, 2016, 1378(185):243-253.

[30]沈立松,马妍慧.质谱技术在检验医学中的应用现状和前景[J].诊断学理论与实践,2012,11(5):536-538.

[31]张自强,李岩.质谱技术在临床生化检测中的应用[J].检验医学,2015,30(5):407-409.

[32]贺冶冰.血浆醛固酮与肾素活性比值测定方法标准化问题的探讨[J].国际内分泌代谢杂志,2008,28(6):374-377.

[33]赖凤华,曹筱佩,林慧美,等.两种血浆肾素、醛固酮检测方法对原发性醛固酮增多症筛查效率的评价[J].中华高血压杂志,2015,23(2):150-153.

[34]邵姣梅,刘钰涛,唐家荣.溶血反应对高血压患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统检测的影响[J].临床内科杂志,2013,30(1):18-20.

[35]陈永跃,刘丹,张屏,等.血管紧张素转换酶抑制剂对高血压患者血浆肾素水平的影响[J].中国分子心脏病学杂志,2016,16(1):1585-1588.

[36]Sealey JE. Plasma renin activity and plasma prorenin assays[J]. Clin Chem, 1991, 37(10):1811-1819.

[37]List of reference measurement methods/procedures for Non-peptide hormones[EB/OL].(2015-01-16)[2016-12-31].http://www.bipm.org/jctlm/

[38]CLSI C62-A.Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Methods; Approved Guideline[S].Clinical and Laboratory Standards Institute,2014.

(本文编辑：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.13

国家质检公益性行业科研指标(201210066)。

李瑾，1992年生，女，硕士研究生，研究方向为临床化学测量标准化。

陈宝荣，主任技师，硕士研究生导师，E-mail：jyk711@sina.com。

R446

A

2016-11-29)