杨再兴,梁艳
(1.台州市第一人民医院、温州医科大学附属黄岩医院检验科,浙江台州 318020; 2.上海长征医院实验诊断科,上海 200003)
系统性红斑狼疮的分子标志物研究进展
杨再兴1,梁艳2
(1.台州市第一人民医院、温州医科大学附属黄岩医院检验科,浙江台州 318020; 2.上海长征医院实验诊断科,上海 200003)
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的实验室诊断和病情判断主要依赖于抗核抗体、抗双链DNA(dsDNA)、抗Sm、抗磷脂抗体等自身抗体。但这些自身抗体存在敏感性或特异性差的缺陷,大大限制其临床价值。因此,迫切需要研发一些新技术及新标志物来解决这些问题。随着分子生物学技术的迅速发展,大量新的分子标志物被发现并鉴定,有望为提升SLE临床诊疗水平提供新契机。该文概括性综述了近年来在SLE中新发现的各种分子标志物,包括基因转录、变异谱、表观遗传谱、游离基因分子谱、胞外颗粒表达谱等,并对这些分子标志物的应用前景和存在的问题进行讨论。
系统性红斑狼疮;分子生物学;标志物
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种典型的系统性自身免疫性疾病,常表现为慢性进行性炎症损伤,可累及全身多个组织器官。血清中特异性自身抗体阳性是SLE的一个重要特征。SLE患者血清中可以出现多种自身抗体,据不完全统计,在SLE患者血清中已经检测出的自身抗体达200余种。目前临床上最为常用,对SLE具有重要临床意义的自身抗体包括抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)、抗Sm、抗核小体、抗核糖体P蛋白、抗组蛋白、抗磷脂抗体等抗体。其中ANA、抗dsDNA、抗Sm、抗磷脂(包括心磷脂和β2糖蛋白1)抗体已被纳入SLE的国际诊断指南,抗dsDNA和抗核小体抗体还可以监测病情和判断疗效。但这些自身抗体在临床诊断应用过程中都存在明显缺陷,有的敏感性高,但特异性差,如ANA;有的则相反,如抗dsDNA、抗Sm等抗体。SLE具有明显的个体异质性,临床表现复杂多样,依靠这些自身抗体进行辅助诊断、病情判断、疗效观察和预后推测很难达到预期效果,迫切需要建立新技术和发现新的标志物来解决这些问题。近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展,大量新技术应用于临床研究和诊断,也为发现和鉴定SLE的分子标志物,提高SLE的临床诊疗水平提供了新的契机。
自从发现DNA分子双螺旋结构以来,分子生物学技术及其相关技术如生物信息学、微电子材料学、大数据统计等取得了突飞猛进的发展。这些技术在疾病分子标志物的挖掘和功能探讨中发挥巨大作用,已逐渐成为临床和实验室诊断研究中的重要热点和最新趋势。其中最为突出的是PCR、基因测序和基因杂交技术的发明和不断的演化、进步以及相互融合。PCR技术已实现了从一代(PCR与电泳技术相结合)到二代(荧光定量PCR技术)再到三代PCR(数字PCR)的迅速更新和发展,分析更加微量化、高通量和准确化。测序技术也迅速从一代(Sanger测序及其衍生的荧光自动测序技术)发展为二、三代(深度测序、单分子测序),也实现了更加微量化和高通量,大大缩短了反应时间,显著节约成本。而且,二、三代测序技术以意想不到的速度迅速成为临床研究和诊断重要工具,即将成为临床常规分子检验的新技术。基因杂交技术从单基因杂交(如Southern blot、northern blot、原位杂交等)快速发展成为以基因芯片为核心,融合其他多种技术方法的高通量、快速分子检测技术。这些技术的快速发展和不断融合,催生和加速了全新研究方法的出现和发展,如基因表达谱和变异谱研究、全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)、转录组学研究、表观遗传组学研究、微生态组学研究和蛋白质组学研究(包括蛋白质芯片和气-质联检技术的应用)等。这些方法在SLE的病因、遗传、发病风险、致病机制、精准诊疗等多个方面研究中得到了广泛的应用,对于SLE相关分子标志物的发现和深入研究具有极为重要的意义[1]。
尽管已经发现在SLE中存在大量表达或结构异常的核酸分子,但目前尚无确定的SLE相关核酸分子标志物。本文所提的SLE相关分子标志物即是指在SLE中表达异常、存在基因变异、表观遗传变化、胞外游离或颗粒中异常增加的基因分子。
2.1 SLE相关的基因表达谱 对 SLE相关的基因转录产物mRNA的研究经历了一个从对单个基因表达水平的探讨到同时高通量检测多个基因表达水平的发展过程。在这一过程中,发现了多种在SLE中表达异常的基因。其中,最重要、与SLE关系最密切、几乎已经肯定参与SLE发病的基因是Ⅰ型干扰素(包括IFN-α、β、δ、ε、κ、τ、ω)转录标签,现已明确,包括Ⅰ型干扰素及其上下游通路的重要调节分子的基因表达水平在SLE中均存在明显异常变化[如多种干扰素调节因子(interferon regulatory factors,IRF)等多达350种左右的信号分子],而且能够在不同程度上反映病情和监测疗效[2]。Munroe等[3]发现,IFN-α活性升高出现在SLE发病前,可以预测SLE的发生,并与SLE特异性自身抗体如抗dsDNA、抗Sm等自身抗体的出现密切相关。该研究还发现,IFN-γ水平升高比IFN-α活性升高和SLE特异性自身抗体出现的时间还要早,提示检测IFN-α活性和IFN-γ水平对于预测和及早发现和诊治SLE具有重要意义。除了干扰素转录标签外,与SLE关系密切的分子还包括B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,Blys)、IL-6、IL-17、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、CD20、Wnt/β-catenin通路相关分子等[4]。在SLE中表达变化的分子多达几百种,但每一种分子对SLE的临床应用价值并不理想,如何能够联合这些分子标签,充分发挥每种分子的最大效能,更好地鉴定症状复杂、诊断困难、病情多变的SLE,成为了相关研究者新的努力方向。一项最新研究在对SLE患者基因转录谱分析时,进行了复杂的模块化组合,结果发现干扰素标签和浆母细胞标签是反映SLE活动度的较好标志物;中性粒细胞相关成分转录谱主要富集于可能发展为活动性狼疮性肾炎(LN)的患者中,而且不同成分组合能够反映不同亚型LN的治疗效果。利用这种模块化组合,有助于对异质性复杂的SLE进行精准诊疗[5]。总之,深入探讨这些分子作为SLE标志物的重要意义体现在,一方面有助于SLE的辅助诊断和病情及疗效判断,另一方面,有助于指导建立以这些分子为靶向的SLE生物治疗方法,如IL-6单抗Tocilizumab、Blys单抗Belimumab、TNF-α抑制物Infliximab和Etanercept、Ⅰ型干扰素抑制物Sifalimumab和Rontalizumab等都已成功用于SLE的临床治疗,而且取得了明显的效果[6]。
2.2 SLE相关的基因变异谱 第一个鉴定的与SLE密切相关的遗传位点位于主要组织相容性复合体(MHC),至今,在所鉴定的所有遗传变异中,MHC基因变异仍与SLE相关性最强[7]。随着检测技术不断发展,特别是GWAS的广泛应用,已鉴定出大量SLE相关基因变异。除了MHC基因变异外,其他SLE相关变异按功能分,大体可分为4个方面:(1)淋巴细胞信号转导通路相关基因变异,包括T细胞和B细胞;(2)干扰素信号转导通路相关基因变异,主要是与核酸识别、干扰素诱导及对干扰素应答的基因变异;(3)凋亡细胞及其细胞垃圾以及免疫复合物清除相关的基因变异;(4)其他功能尚无法归类的基因变异[8-9]。每一个方面都包括多种基因变异,这些变异单独或联合影响着SLE的遗传风险。但是,目前为止,尚未确定哪一种或几种变异可以决定SLE发病。而且,很多变异都是SLE和其他疾病如类风湿关节炎、糖尿病等的共同风险因素。这说明SLE是一个复杂性疾病,并非绝对遗传病,非检测一种或几种基因变异就能解决。
2.3 SLE相关的表观遗传谱
2.3.1 组织及细胞基因分子谱 表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的调节作用。目前研究最多的非编码RNA是微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long no-coding RNA,lncRNA)和新近的热点环状RNA。关于DNA甲基化研究也经历了从单个基因甲基化,到覆盖全基因组的甲基化研究,而且研究样本的选择也从笼统的外周血白细胞转为精细研究外周血各种细胞群和亚群(如CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、单核细胞等)。大量研究表明,在SLE中存在很多异常DNA甲基化,如外周血白细胞中Ⅰ型干扰素为代表的大量炎症相关分子甲基化降低,与调节性T细胞密切相关的插头蛋白3基因调节性T细胞特异性去甲基化区(FOXP3 TSDR)甲基化增高,单核细胞、B细胞和CD4+T细胞中干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)甲基化降低,CD4+T细胞中IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、CD40L、CD70等多种与炎症和免疫相关的分子甲基化降低等[10]。这些甲基化形式有利于促炎因素的过度活化,参与SLE发生发展。当然,一些外周血细胞中的分子甲基化水平也可以作为分子标志物有助于SLE的辅助诊断和病情判断。我国学者研究发现,外周血细胞中干扰素诱导蛋白44(IFI44L)基因启动子区两个位点低甲基化水平对SLE具有极好的诊断准确性,两个位点的敏感性可以分别达到93.6%和94.1%,特异性分别达到96.8%和98.2%[11]。此外,另有研究表明,CD11a、CD70、CD40L和穿孔素等分子基因启动子区甲基化水平也有助于快速诊断和鉴别SLE[12]。此外,基因甲基化还具有潜在反映病情和预测器官损伤的功能,如调节性T细胞特异性转录因子FOXP3基因甲基化水平增高提示SLE活动性增加[13],而IFI44L基因启动子去甲基化水平增高则提示SLE病情处于恢复期[11]。
组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等。在SLE中已发现存在大量组蛋白修饰异常情况,如SLE患者CD4+T细胞中组蛋白H3、H4总乙酰化水平降低,影响近180个相关基因表达,而且H3乙酰化水平与SLE活动度密切相关[14]。目前关于组蛋白修饰异常在SLE中的作用机制研究较多,而探讨其对SLE临床价值的较少。miRNA是长度为20~30个核苷酸的单链小分子非编码RNA,是表观遗传学调控中的重要成员。在SLE患者外周血细胞中存在大量miRNA异常表达,而且多数都与疾病活动程度密切相关,如miR-148a、-126、-21和-155表达明显升高,miR-31、-142s、-142-3p、-142-5p、-146a和-125a表达明显降低[15]。血细胞中miRNA水平的影响因素较多,包括血细胞数量、组成比例(如T、B、单核细胞等)、活化状态等,因此,不宜用作SLE的临床标志物。lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,与miRNA一样,lncRNA是重要的表观遗传学调控因子。目前关于lncRNA与SLE关系的研究还较少,仅发现linc0949和linc0597在SLE患者外周血细胞中表达降低,其中linc0949的降低水平与疾病活动度、肾损伤等情况有关,并可以反映治疗效果,核paraspeckle 小体装配转录子1(nuclear paraspeckle assembly transcript,NEAT1)在单核细胞中表达升高[10,16]。关于环状RNA在SLE中的情况,目前尚未见相关报道。
2.3.2 游离基因分子谱 此处所提到的“游离基因分子谱”指的是血浆或血清(所谓的循环中)及其他体液(如尿液、脑脊液等)中游离的DNA、miRNA和lncRNA。早在50年前,就有研究报道在SLE患者血清中检测到DNA及抗DNA抗体。之后,又发现SLE血清或血浆中也存在异常升高的DNA或甲基化DNA分子,而且部分增高的游离DNA可以反映SLE疾病活动度。特别是Chan等应用基因组和甲基化组学测序方法在全基因组范围对SLE患者血浆进行了高分辨分析,发现SLE中检测基因组代表(measured genomic representations,MGRs)异常,而且异常程度与抗dsDNA抗体水平密切相关,同时证实游离DNA片段长度越短,甲基化程度越低,患者病情活动越强[17]。
SLE患者血浆中miR-21、-181a、-196a、-30e-5p、-92a-3p和miR-223-3p明显上调,其中miR-196a对SLE辅助诊断价值较大,miR-21与疾病严重程度密切相关,miR-223-3p与SLE发生口腔溃疡及出现狼疮抗凝物有关[18-19]。SLE患者血清中miR-146a水平降低,与疾病活动度及蛋白尿呈负相关,但尿液中的miR-146a明显增加,并与肾小球滤过功能损伤相关[15]。儿童狼疮性肾炎患者尿液中的miR-125a、-127、-146a、-150和155明显升高,且与肾炎活动度有关[20]。
游离DNA及其甲基化产物和miRNA相对比较稳定,抽提、检测方便,影响因素相对较少,可能是SLE临床应用最有前景的分子标志物之一。
2.3.3 SLE相关的胞外颗粒表达谱 胞外颗粒是指外泌体、循环微粒、中性粒细胞胞外陷阱(NET)等。胞外颗粒作为载体,携带大量信息分子(包括miRNA)在细胞间进行交流传递。这些胞外颗粒的数量变化和表达分子可能会成为SLE辅助诊断和病情监测的潜在标志。研究表明,LN患者尿液外泌体中miR-125a、-150、-155和-146升高,而miR-141、-192、-200a、-200c、-221、-222和-429明显降低[21]。尿外泌体中的miR-29c对LN发生早期肾纤维化有较好预测价值,其预测敏感性和特异性分别为94%和82%[22]。循环微粒是另一种直径为100~1 000 nm的胞外颗粒,SLE患者中循环微粒数量明显增多,约为正常人2~10倍[23]。而且,循环微粒中的DNA膜渗透性更好,不易被DNA酶消化降解,因此更易诱发抗dsDNA抗体产生[24]。循环微粒及其含有的分子有望成为SLE新的分子标志物。NET是中性粒细胞在一定刺激条件下释放至胞外的网状结构,内含大量DNA、组蛋白及蛋白酶等物质。在SLE中,NET明显增多,推测其含有的DNA是SLE自身抗原的重要来源,而且NET在SLE发病中具有重要作用[25],但NET及其含有的DNA是否能够成为SLE的重要分子标志,尚待进一步探讨。
2.4 其他 质谱也是一项发展迅速而且在临床应用越来越广泛的重要技术。该技术也广泛应用于SLE相关标志物的挖掘研究,并且鉴定出至少200余种与SLE密切相关的蛋白质标志物[26]。这些标志物对于SLE的辅助诊断、病情及组织器官损伤情况的判断等可能具有重要的潜在应用价值。因为本文着重讨论SLE相关的基因标志物,对于此部分内容并未展开。
已发现的SLE相关分子标志物真正应用到临床常规检验尚需时日。主要原因包括以下几点。(1)分子标志物本身对SLE的临床价值仍然有限。尽管这些分子与SLE发病密切相关,有些也是SLE的重要风险因子,很多分子也成为SLE的重要治疗靶点,但这些分子普遍对SLE特异性偏低,无法实现较好的辅助诊断作用。(2)关于基因变异的研究,有统计学意义的阳性结果众多,但有临床意义的结果寥寥。而且,对于结果的分析和总结千头万绪,错综复杂,绝大多数基因变异是多种自身免疫病共有的,难以找到最为关键的致病基因。(3)分子标志物的检测方法有待进一步性能验证。如上所述的各种分子标志物检测方法都处于科研阶段,其灵敏度、特异性、准确度、精密度等很多性能指标都没有经受过严格的标准检验。当然,随着重要的、临床所必需的分子标志物的发现,其检测方法性能验证问题也将很快解决。
尽管还存在很多问题,但分子检测已成为不可阻挡的潮流,必然会广泛应用到临床。关于其在SLE中的发展趋势,笔者认为可能主要在以下几个方面:(1)鉴定出具有重要诊断价值的分子标志物,与自身抗体等目前常规检测指标相联合,提高对SLE的诊断水平;(2)鉴定出大量分子标志物,并通过模块化组合,实现对SLE的精准预测(包括发病的症状前预测、病情发展预测及疗效预测),从而实现对SLE患者的个体化健康管理,有效预防,精准干预和治疗;(3)针对SLE密切相关的分子标志物,研发靶向药物,有助于提高对SLE的治疗水平。当然,实现美好愿景的过程充满机遇和挑战。
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(本文编辑:刘群)
10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.03
杨再兴,1978年生,男,研究员,博士,从事自身免疫性疾病临床和实验室诊断研究,E-mail:yangzaixingdiyi@163.com。
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2016-12-09)