类风湿关节炎生物标志物研究进展：从蛋白质到非编码RNA*

杨阳，李晓军

(解放军南京总医院中心实验科，南京 210002)

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类风湿关节炎生物标志物研究进展：从蛋白质到非编码RNA*

杨阳，李晓军

(解放军南京总医院中心实验科，南京 210002)

生物标志物(biomarker，BM)作为重要的辅助诊断指标，被广泛用于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的诊断、分型、炎症活动度、治疗反应性及预后的判断。目前，类风湿因子(rheumatoid factor，RF)和抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)已经成为RA的诊断指标之一。随着蛋白质组学和表观遗传学的发展，以蛋白质和非编码RNA为指标的检测技术日益完善，更多的蛋白质、微小RNA(microRNAs)和长链非编码RNA(long non-coding RNAs)被发现和确认，有些已成为RA潜在的BM。虽然这些BM的临床意义尚有待更多临床大数据的验证，但是这些新型BM的发现仍然为RA的早期诊断和精确治疗提供了新的思路。该文对RA相关的BM及其作用作一评述。

类风湿关节炎；生物标志物；蛋白标志物；非编码RNA

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以手足小关节滑膜腔慢性炎症为主要特征的自身免疫病，起病隐匿，病因不明。全球RA的发病率为0.5%～1%[1]，好发于35～50岁的中青年人群[2]。RA患者早期表现为非典型性关节炎，晚期可以进展为关节肿痛，并且伴有不同程度的骨质破坏和关节畸形。研究表明，在RA的早期(3～6个月内)新型生物制剂如抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体等药物的治疗可以极大地缓解关节炎症状，并延缓疾病进展[3-4]，然而这些昂贵的生物制剂仅能使部分患者受益。而利用生物标志物(biomarker，BM)对RA患者的病程和病情、遗传学背景、表观遗传学等特性做出综合判断，可以达到早期诊断疾病、疾病分层管理、合理使用药物的目的，从而实现RA的精准化诊治，提高RA患者的生存质量。蛋白质类BM如自身抗体是最早广泛应用于临床患者的诊疗过程的标志物。近年来，非编码RNAs在RA中的作用也越来越受到关注[5]，这些潜在的BM对RA诊疗的意义也将随着基础和临床研究的深入得到进一步确认。

1 蛋白质类BM在RA诊疗中的意义

蛋白质类BM是临床最常用的标志物之一。在RA诊疗中，蛋白质类BM主要包括各种自身抗体和炎症相关分子。自身抗体是针对自身组织成分的免疫球蛋白(Ig)，可激活补体系统，介导关节组织的慢性炎症。自身抗体参与RA的发病过程，也是RA的BM[6]。炎症相关分子则是判断炎症活动情况的指标，通常反映疾病活动和关节损伤程度。

1.1 自身抗体

1.1.1 类风湿因子(rheumatoid factor，RF) RF是以变性IgG类抗体的Fc段为靶抗原的自身抗体，最早被列入美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)制定的RA诊断分类标准，曾经是RA最常用的诊断指标之一。在未经治疗的RA患者中RF的阳性率可达70%～80%，对RA的诊断具有相对特异性，高滴度的RF常伴有严重的活动性关节疾患及全身并发症，预后较差，症状缓解后RF的值明显下降。然而RF也可见于多种自身免疫病及一些与免疫有关的慢性感染如SLE、骨关节炎、Sjögren综合征、慢性肝炎、结核病等，甚至一部分正常的老年人群中也会出现阳性，因此RF的特异性较低。另外在RA的早期通常表现RF阴性，因此RF在RA的早期诊断中存在一定的局限，更多地作为疾病分层、治疗效果的监测指标[7]。RF分为IgG、IgA、IgM、IgE和IgD 5个亚类，与疾病活动性及并发症的出现密切相关，其中IgM类RF与RA的预后关系密切，高滴度的IgM类RF提示预后不良；而IgA类RF的含量与RA患者的血管炎和关节外症状密切相关[8]。因此对RF及其Ig亚类的检测有助

于RA的诊断、治疗效果和预后的判断。

1.1.2 抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体 抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)是存在于RA患者血清及关节液中的另一种重要的自身抗体[9]，以滑膜中瓜氨酸的纤维蛋白原、中间丝蛋白、角蛋白、波形蛋白等为靶抗原。目前检测ACPA多采用CCP作为捕获抗原，检测出的抗CCP抗体是一类总的ACPA复合型抗体。2010年ACR和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)将抗CCP抗体连同RF列入新的RA分类标准。ACPA已成为国际公认的早期诊断RA及判断关节损伤的特异和灵敏的指标。前瞻性队列研究显示，大约75%ACPA阳性而没有关节炎症状的人群在未来3年内将进展成为RA，提示ACPA具有更好的早期诊断意义[10]。ACPA也可以作为疾病亚型分类的指标。根据ACPA的检出情况，RA可以分成两个亚型：ACPA阳性RA和ACPA阴性RA。与ACPA阴性患者相比，ACPA阳性的RA患者具有更严重的关节炎症状，而治疗效果却相对较好[11]。

1.1.3 抗突变型瓜氨酸波形蛋白(mutated citrullinated vimentin，MCV)抗体 抗MCV抗体的靶抗原是经由肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)瓜氨酸化后的波形蛋白。抗MCV抗体诊断RA的敏感性达70.7%～78.2%，而特异性为93.4%～95%。其与疾病活动度密切相关，是具有良好潜在应用价值的自身抗体[12]。

1.1.4 其他自身抗体 除了以上几种常用的自身抗体之外，陆续又发现了多种自身抗体。一项回顾性研究显示，38%的患者在出现RA症状前就出现了抗氨甲酰抗体(anti-carbamylatedprotein，anti-CarP)[13]。Tanaka等[14]报道，与其他关节炎患者相比，RA患者体内出现了更高水平的抗垂体特异性因子1α(pituitary gland specific factor 1α，PGSF1α)抗体；50%的RF阴性RA患者可检测出抗PGSF1α抗体阳性，可见抗PGSF1α抗体对RF阴性RA患者的诊断具有较好的提示作用。蛋白质组学技术成为发现新的蛋白类BM的重要手段。Park等[15]通过对RA患者尿液中蛋白质的分析，发现了α-酸性糖蛋白1(ORM1)、α-酸性糖蛋白2(ORM2)和溶解型CD14在RA患者尿液中表达升高，是潜在的与RA活动度正相关的BM。

1.2 炎症反应性蛋白 C反应蛋白(C-reactive protein)是一类急性反应性蛋白，主要反映急性炎症的活动性[6]。在活动性RA患者血浆中CRP水平明显升高，且CRP升高的水平与疾病的活动性正相关[16]。Smolen等[17]研究显示，CRP可以作为关节损伤程度的预测指标。目前，CRP与血沉(erythrocyte sediment rate，ESR)均被列入关节炎活动性评分的标准之一，用于疾病进展和治疗效果的评价[18]。

1.3 蛋白质类BM在伴随诊断(companion diagnostic)中的作用 伴随诊断是指通过对BM的检测来预测患者对某类治疗药物的反应性。近年来，抗体靶向类药物，如抗TNF-α单克隆抗体药物英夫利昔单抗(infliximab)，在RA患者治疗中得到广泛应用，然而有相当部分患者对这类药物无效，其主要原因之一是患者血液中出现了抗药抗体，导致药物被迅速清除，无法维持血药浓度，因此，正确预测这部分患者是提高治疗效果的重要环节。St Clair等[19]通过一项多中心双盲实验发现，CRP水平与infliximab的血药浓度负相关，也与其治疗的效果密切相关。为了提高预测的准确性，Heuber等[20]采用了一组含13个自身抗体和11个细胞因子的检测组合，来预测RA患者对抗TNF-α抗体治疗的作用效果，结果显示这个组合具有较好的预测价值。

2 非编码RNAs是RA诊疗中的潜在BM

非编码RNAs是一类不编码蛋白质的RNA，包括microRNAs、长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)等。近年来，非编码RNAs在RA的发病发展过程中的调节功能和作用机制受到广泛关注。自从2008年Mitchell等[21]报道非编码RNAs(microRNAs)可以稳定地存在于血浆以来，陆续在血浆、外泌体、关节液和外周血淋巴细胞中检测非编码RNAs[22]，提示非编码RNAs可能成为另一类理想的BM[23-24]。

2.1 microRNAs miR-146a是重要的炎症调控分子，高表达于RA患者滑膜腔TH17、巨噬细胞、B细胞以及外周血淋巴细胞中，进一步的相关和回归分析发现，miR-146a的表达水平与关节炎活动度相关[25]。然而miR-146a表达具有非特异性，作为RA早期诊断指标之一还具有一定的局限性。Ormseth等[26]在RA患者血浆中发现了多个差异表达的miRNAs，如miR-24-3p、miR-26a-5p和miR-125a-5p等均表达升高，且与RA的早期诊断密切相关。Duroux-Richard等[27]发现，RA患者外周血中miR-125b表达升高，高表达miR-125b的RA患者对利妥昔单抗(rituximab)治疗反应性较好。

2.2 lncRNAs 通过大规模高通量测序和生物信息学技术，在RA患者组织、细胞和体液样本中发现差异表达的lncRNAs。Mayama等[28]研究发现，lncRNAGas5(growth arrest-specific 5)高表达于RA患者的外周血白细胞;Lu等[29]发现lncRNALOC100652951和LOC100506036高表达于RA患者外周血T淋巴细胞;Song等[30]发现，lncRNAHotair高表达于RA患者外周血单核细胞和血清外泌体，Hotair通过上调金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-13的活性，增强巨噬细胞迁移的能力。Messemaker等[31]研究发现在RA易感基因TRAF1-C5间存在一个新的lncRNA:C5T1lncRNA，在RA滑膜成纤维细胞中C5T1lncRNA的表达水平与补体C5的水平呈正相关，提示C5T1lncRNA可能通过调控RA相关基因C5的表达促进RA的发生发展。Zhang等[32]采用基因芯片技术发现，lncRNAENST00000483588在RA患者的成纤维样滑膜细胞中表达上调，而ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247表达下调。ENST00000483588、ENST00000438399、uc004afb.1和ENST00000452247诊断RA的ROC曲线下面积分别是0.85、0.92、0.97和0.92，提示这些lncRNAs对RA具有较好的诊断价值，是RA诊断的潜在BM。另外，在RA患者中，ENST00000483588的表达水平与C反应蛋白(CRP)水平和简化的疾病活性指数(SDAI)得分呈正相关。目前，lncRNAs作为RA BM的研究方兴未艾，但是其临床意义尚需进一步验证。

3 小结及展望

由于RA的高度异质性，对患者血浆、滑膜腔、免疫细胞内多种BM的综合性分析对于实现早期诊断和个体化治疗具有重要的意义。目前，遗传学和表观遗传学的评价指标在临床上评价作用还需要进一步验证，其中对多种循环非编码RNAs如miRNA和lncRNA等组合进行检测，可能为RA的诊断和治疗带来突破性的进展[33]。然而，在将这些指标正式运用到临床工作之前，还面临许多挑战，诸如在检测样本(血细胞、血清、血浆、外泌体、尿液、胸腹水等)的获取、储存及处理，RNA的纯化，miRNA及lncRNA的检测、以及患者个体的生理病理等方面都存在许多可变因素，必须建立一整套标准化的检测操作规程及统一可行的方法，最大程度地减少从分析前到分析中各因素的干扰，以期获得相关非编码RNAs在RA诊治中确切价值的可靠证据。随着这些新型诊断指标的发现和深入研究，可望其中某些非编码RNA或其组合会成为早期诊断RA和预测治疗反应的准确、敏感的临床标志物。

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(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.01

国家自然科学基金(81470071)；国家临床重点专科军队建设项目(2014ZDZK003)；江苏省临床医学科技专项(BL2014072)。

杨阳，1987年生，男，主治医师，博士研究生，主要从事自身免疫疾病的诊断和机制研究。

李晓军，主任技师，教授，博士研究生导师,E-mail:xiaojunli62@126.com。

R446.6

A

2016-11-22)