茉莉酸甲酯对明党参植株和悬浮细胞中呋喃香豆素积累的影响

蔡静+马赟++陈建伟+李祥+周萍

[摘要]佛手酚、佛手柑内酯和花椒毒素为明党参中天然呋喃香豆素成分，具多重药理作用。以明党参栽培品和悬浮培养细胞为材料，研究茉莉酸甲酯处理后呋喃香豆素积累状况和一系列生理生化指标变化。结果显示，茉莉酸甲酯不同程度地促进明党参中各呋喃香豆素合成，柄悬浮细胞中产量高于叶悬浮细胞。于培养周期第10天加入100 μmol·L-1茉莉酸甲酯对明党参悬浮细胞作用效果最明显，最适收获时间为处理4 d后，此时柄悬浮细胞中佛手酚，花椒毒素和佛手柑内酯产量分别是未诱导细胞的736，19，427倍。茉莉酸甲酯诱导呋喃香豆素增长的同时抑制细胞活力和生物量积累，激发细胞防御反应。该研究初次系统地探索了茉莉酸甲酯对明党参中呋喃香豆素的诱导效果，并为大量生产3种活性成分和探明茉莉酸甲酯诱导机制奠定基础。

[关键词]明党参； 呋喃香豆素； 茉莉酸甲酯； 诱导

明党参Changium smyrnioides Wollf为我国特有的伞形科植物，收录于《中国植物红皮书》，属易危级[12]。其根作为药材明党参载于现版药典，具润肺化痰，养阴和胃，解毒之功效[3]，亦作为重要药材行销东南亚各地。明党参活性成分的前期研究着重于多糖、脂肪酸和挥发油等方面，呋喃香豆素是近年来研究较多的特征性成分[4]，广泛存在于明党参全株及组织培养材料中[57]，是明党参滋补強壮功效的物质基础之一，现代药理研究认为其具有抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、抗惊厥等多重药理活性[811]，极具开发利用价值。

组织培养技术可用于生产药用植物有效成分，结合诱导子可获取大量目标产物，明党参在此方面的研究较少且前期仅以多糖为指标，鲜有以呋喃香豆素为目标的培养研究[1215]。茉莉酸甲酯（MeJA）作为植物信号分子和常用的化学诱导子[1617]，对多种植物器官或组织培养材料中香豆素类成分表现出明显的诱导作用[1821]。本实验首次系统地探索MeJA对明党参原植株和悬浮细胞生长的影响和其中3种呋喃香豆素的诱导效果，以期获得最高产量，为进一步用于扩大化生产这3种天然产物奠定基础，也为呋喃香豆素资源的开发和珍稀药用植物明党参的可持续利用提供新途径。另一方面，本实验探讨了诱导过程中一系列植物生理生化指标的变化，为研究MeJA对明党参的诱导机制提供依据。

1材料

11样品植物材料栽培于南京中医药大学仙林校区药苑，经南京中医药大学中药资源教研室陈建伟教授鉴定为伞形科明党参Ch smyrnioides。取幼嫩叶与叶柄诱导愈伤组织，采用MS培养基，激素配比分别为NAA 15 mg·L-1+2，4D 05 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L-1和NAA 15 mg·L-1+2，4D 15 mg·L-1+KT 02 mg·L-1+6BA 05 mg·L1[12，22]。初代愈伤组织继代3次后，用镊子捏碎接种于对应的pH为58，含蔗糖30 g·L-1的MS液体培养基中，于25 ℃，光照强度1 500 lx，转速120 r·min-1的摇床中培养。选取生长力强且含呋喃香豆素较多的叶和叶柄初代悬浮细胞系经50目镍网滤过，作为细胞母液继代备用，继代起始浓度为干重20 mg·L-1。

12仪器与试剂DHZDA冷冻恒温振荡器（太仓实验设备厂）；SPX300BG光照培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；FD1A50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世公司，Waters 2998 PDA检测器）；KH500DB数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。对照品花椒毒素（批号JN01KEJR，东京化成工业株式会社）；对照品佛手柑内酯和佛手酚为本实验室自明党参根皮分离而得，经HPLC归一化测定，纯度均大于98%。色谱级甲醇（江苏汉邦科技有限公司），其余试剂为分析纯。

2方法

21MeJA对明党参植株呋喃香豆素积累的影响于4月上旬明党参生长旺盛时期向其地上部分均匀喷施200 μmol·L-1MeJA，对照组喷以蒸馏水，处理后第0，1，2，3，4，5天采收并分拣叶与叶柄，测定呋喃香豆素含量。

22MeJA浓度对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响取同批继代的悬浮细胞，在生长周期第8天向培养体系中分别加入0，50，100，200 μmol·L-1MeJA，继续培养5 d后收获样品，测定细胞生物量、活力和3种呋喃香豆素含量。

23MeJA加入时间点对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响取同批继代的悬浮细胞，分别在生长周期第0，5，8，10，12 天加入100 μmol·L-1MeJA，继续培养至第15 天收获样品，测定细胞生物量、活力和3种呋喃香豆素含量。

24MeJA处理后明党参悬浮细胞呋喃香豆素动态积累取同批继代的悬浮细胞，在生长周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA，处理后第0 天起每天收获样品直至第5天，测定细胞生物量、活力、3种呋喃香豆素含量和相关生理生化指标。

25细胞生物量及活力测定量得悬浮细胞培养物总体积，抽滤后称重，其与培养物总体积比值为细胞鲜重，细胞经冷冻干燥后再次称量，其与培养物总体积比值为干重。采用TTC法测定活力[2324]，精密称取02 g新鲜收获的细胞于离心管中，加04% TTC溶液和01 mol·L-1 pH 70 PBS溶液各25 mL，混匀，25 ℃避光反应20 h。离心，弃上清，加5 mL无水乙醇，混匀，于60 ℃水浴并振荡30 min，冷却，离心，取上清，测定485 nm处吸光度，其与样品质量比值即为细胞活力值。

26呋喃香豆素含量测定分别测定细胞与培养液中呋喃香豆素含量，两者之和为悬浮细胞体系中总量。取明党参细胞冻干粉末（过4号筛）05 g，精密称定，加甲醇50 mL，于60 kHz超声提取60 min，过滤，滤液挥发溶剂，用甲醇定容至5 mL，过045 μm滤膜，即得细胞供试品溶液。量得滤后培养液总体积，取50 mL，于40 ℃减压干燥，加甲醇溶解，收集滤液，挥发溶剂，用甲醇定容到2 mL，过045 μm滤膜，即得培养液供试品溶液。采用高效液相色谱法测定3种香豆素含量，参照周萍等[13]方法，AgilentC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长为314 nm，进样量为10 μL，流速为10 mL·min-1，水（A）甲醇（B）梯度洗脱程序为0～5 min，80%～70% A；5～25 min，70%～60% A；25～35 min，60%～40% A；35～50 min，40%～30% A；50～60 min，30%～0% A；60～70 min，0%～80% A。原植物叶、叶柄处理和测定方法与明党参细胞相同。

27生理生化指标测定可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法，脯氨酸和丙二醛含量、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均参照蔡庆生[25]的方法测定。

28数据处理利用Excel和SPSS 220软件进行数据处理，处理间差异采用新复极差法（Duncan′s）比较，显著水平为005，结果以±s表示。

3结果与分析

31MeJA对明党参植株呋喃香豆素积累的影响处理后，花椒毒素和佛手柑内酯含量均明显增长，两者在叶中的含量最高达到对照的149，171倍，在柄中的含量最高达到对照的144，162倍，表明MeJA可有效诱导明党参植株中2种呋喃香豆素合成。花椒毒素和佛手柑内酯受诱导后变化趋势一致，但叶柄对MeJA诱导的反应进程更快（图1）。MeJA可模拟类似昆虫取食、机械损伤效果从而诱发防御行为，呋喃香豆素是明党参产生的一类化学防御物质，研究表明由于植物生长和防御都需使用有限的资源，因而植物在权衡两者的前提下做出直接防御、间接防御、不防御、负防御4类不同反应[2627]，就明党参而言，先在更靠近地表的叶柄部位重点合成防御物质，以抵抗昆虫取食等机械伤害，后重點转向主要承担光合作用、对生长更重要的叶部分。这可能是柄对诱导的应答更早而叶中呋喃香豆素积累作用更持久的原因。

32MeJA浓度对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响随着MeJA浓度的增加，细胞生物量和活力与0 μmol·L-1处理相比均持续下降，3种呋喃香豆素含量与产量先升后降。其中花椒毒素主要积累于细胞内，佛手酚主要释放于培养液，佛手柑内酯在细胞内外均有分布但以培养液中更多。浓度为100 μmol·L-1时三者含量和产量达到峰值，故该浓度是诱导明党参悬浮细胞产生呋喃香豆素的最佳浓度（图2）。

33MeJA加入时间点对明党参悬浮细胞呋喃香豆素积累的影响随MeJA加入时间点的推后，所得细胞生物量和活力总体上升，说明MeJA对明党参细胞生长有抑制作用，细胞生长到一定时期（8 d及以后），积累一定生物量可缓解此抑制作用（图3）。8，10 d处理所得3种呋喃香豆素含量与产量明显高于其他组，含量上10 d处理略高于8 d处理或与之持平，但产量上均为10 d处理最高，故在细胞培养周期第10 天加入MeJA最佳。一般认为细胞生长指数后期或稳定前期是进行诱导处理的最佳时

A叶悬浮细胞；B叶柄悬浮细胞；n=4。

机[28]，本实验中10 d即为指数后期，而稳定前期（12 d）的明党参悬浮细胞对MeJA的反应显著弱于10 d，说明此阶段细胞对诱导敏感性已大大降低。一定的细胞密度有利于细胞间信号传递，故初期加入MeJA诱导所得呋喃香豆素含量也较低。

34MeJA处理后明党参悬浮细胞呋喃香豆素动态积累处理后生物量缓慢增加后趋于稳定，活力在1 d明显下降后变化减缓。呋喃香豆素积累趋势大体相同，含量快速上升至3 d左右进入平稳期，产量多于4 d达到峰值，故诱导后4 d为适宜收获时期。柄源细胞中花椒毒素与佛手柑内酯含量变化优先于叶源细胞，这与处理原植物所得结果一致，说明悬浮细胞虽经脱分化但仍保有原外植体器官的一定特性（图4）。

与0 d相比生理生化指标总体先升后降，脯氨酸无显著变化，可溶性蛋白和丙二醛变化较缓，表明MeJA对明党参细胞膜系统造成一定程度氧化损伤但渗透胁迫较弱。各指标峰值出现于2 d左右，5 d多降回原水平，说明MeJA引起细胞防御反应，抗氧化酶活性的快速上升正是防御行为的体现，这与李阳等[29]研究结果一致。抗氧化酶缓解氧化损伤，故未造成后续明显渗透胁迫，PAL为呋喃香豆素生物合成上游的关键酶，MeJA激发其活性短期升高，继而呋喃香豆素大量积累。POD与PAL在柄细胞中的变化优先于叶细胞，这使得柄细胞活力受MeJA抑制后恢复更快且呋喃香豆素积累也更早。

与未加诱导的悬浮细胞相比，在培养周期第10天加入100 μmol·L-1MeJA诱导4 d的悬浮细胞中呋喃香豆素含量和产量有大幅提升（表1），花椒毒素和佛手柑内酯提升幅度叶细胞大于柄细胞，但3种呋喃香豆素含量和产量均为柄悬浮细胞更大。与原植物叶柄相比诱导后柄悬浮细胞花椒毒素含量仍较低，但其增添了叶柄中原本没有的佛手酚且佛手柑内酯含量为原叶柄的39倍，故MeJA诱导的柄悬浮细胞可作为佛手酚和佛手柑内酯的生产资源。

4讨论

不加诱导子的明党参悬浮细胞中呋喃香豆素含量很低，但经MeJA诱导后增加十分显著，说明明党参悬浮细胞本身具有很大的生产呋喃香豆素潜力，而MeJA直接或间接地激活了合成途径一系列酶。Chen等[19]对高氏柴胡不定根的诱导研究也发现MeJA可上调苯丙素类物质相关基因表达，从而进一步合成香豆素等下游物质。

原植株中佛手柑内酯和花椒毒素含量明显高于悬浮细胞，但原植物叶和叶柄中均未检出佛手酚。这与细胞状态有关，分化与脱分化细胞中酶种类及酶活力存在差异。呋喃香豆素的生物合成途径中，补骨脂素在花椒毒酚合酶和佛手酚合酶的作用下分别转化成花椒毒酚和佛手酚，继而再分别合成花椒毒素和佛手柑内酯[3031]。脱分化的悬浮培养细胞中各酶可能处于抑制状态，因而呋喃香豆素含量较低，而分化的原植株细胞中佛手酚O甲基转移酶活性可能较高，从佛手酚到佛手柑内酯的步骤进行的较为彻底，因此未检出佛手酚。另一方面，原植物器官和悬浮细胞对MeJA处理的不同反应可能也出于两者细胞状态的不同，悬浮细胞虽分别源于叶和叶柄，但都已处于脱分化的均一状态，所以接受诱导后变化趋势基本一致，而叶和叶柄作为完全分化的器官，根据各自功能的不同作出不同的反应。

无论在原植物还是悬浮细胞中，经MeJA诱导的花椒毒素含量上升幅度都不及佛手酚和佛手柑内酯，说明MeJA虽对多种植物次生代谢产物有效[17]，但也具一定选择性。本实验中3种呋喃香豆素结构相似，合成途径相近，MeJA对三者诱导效果的差异还需从其诱导机制的细节上寻找原因，同时可继续探寻对花椒毒素作用更明显的诱导子。

MeJA浓度是影响诱导效果的重要因素，不同植物及培养体系所需最佳浓度有较大差异，主要从5 μmol·L-1至500 μmol·L-1不等，但以100 μmol·

本实验所用MeJA和已报道对诱导明党参悬浮细胞呋喃香豆素有效的水杨酸[13]均为植物信号分子类物质，与防御相关的信号分子还包括寡聚糖、脱落酸、乙烯等[27]，可重点考察此类物质以进一步寻找有效的诱导子。研究中诱导物质多为一次性加入，可尝试多次加入，研究可否产生叠加增效。诱导子间可产生互作，从而达到比单一使用更佳的效果[23]，可在寻得有效诱导子的基础上，探索明党参悬浮细胞中诱导子互作效应，以期获取更高产量的有效成分。

[参考文献]

[1]厉彦森，郭巧生，王长林，等 明党参野生居群生物学及其药材质量调查[J] 中国中药杂志，2007，32（22）：2349

[2]傅立国 中国植物红皮书[M] 北京：科学出版社，1991：532

[3]中国药典一部[S] 2015：210

[4]季晓，宣槐斌，黄宝康 明党参活性成分及药理作用研究进展[J] 药学实践杂志，2015，33（2）：102

[5]白钢钢，袁斐，毛坤军，等 明党参根皮化学成分研究[J] 中草药，2014，45（12）：1673

[6]任东春，钱士辉，杨念云，等 明党参化学成分研究[J] 中药材，2008，31（1）：47

[7]步达，姚晓，郑紫婷，等 HPLC法测定明党参组织培养物和栽培品中香豆素成分的含量[J] 天然产物研究与开发，2014，26（10）：1638

[8]王萌，陈建伟，李祥 明党参根皮中5种呋喃香豆素类成分的体外抗肿瘤活性[J] 中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：203

[9]Buyukguzel E， Hyrsl P， Buyukguzel K Eicosanoids mediate hemolymph oxidative and antioxidative response in larvae of Galleria mellonella L[J]Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2010，156（2）：176

[10]Shikishima Y， Takaishi Y， Honda G， et al Chemical constituents of Prangos tsehimganica，structure elucidation and absolute configuration of courmarin and furanocoumarin derivatives with antiHIV activity[J]Chem Pharm Bull，2001，49（7）：877

[11]SkalickaWoz'niak K， Zagaja M， Gtowniak K， et al Purification and anticonvulsant activity of xanthotoxin （8methoxypsoralen）[J]Cent Eur J Biol，2014，9（4）：431

[12]江曙，段金廒，陈建伟，等 明党参愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养的研究[J] 中国中药杂志，2009，34（9）：1078

[13]周萍，谢晨琼，陈建伟，等 抗褐化剂对明党参悬浮细胞生长和次生代谢产物含量的影响[J] 中药材，2015，38（11）：2250

[14]江曙，段金廒，陶金华，等 明党参内生真菌种群的生态分布及其诱导子活性研究[J] 中草药，2010，41（1）：121

[15]周萍，谢晨琼，陈建伟，等 诱导子和前体物质对明党参悬浮细胞中3种呋喃香豆素合成的影响[J] 中成药，2016，38（8）：1760

[16]Gundlach H， Muller M J， Kutchan T M， et al Jasmonic acid is a signal transducer in elicitorinduced plant cell cultures[J].Chem Pharm Bull，2001，49（7）：877

[17]Charu Chandra Giri， Mohd Zaheer Chemical elicitors versus secondary metabolite production in vitro using plant cell， tissue and organ cultures：recent trends and a sky eye view appraisal[J] Plant Cell Tiss Organ Cult，2016，126（1）：1

[18]Miksch M， Boland W Airborne methyl jasmonate stimulates the biosynthesis of furanocoumarins in the leaves of celery plants （Apium graveolens）[J] Experientia，1996，52（7）：739

[19]Chen L R， Chen Y J， Lee C Y， et al MeJAinduced transcriptional changes in adventitious roots of Bupleurum kaoi[J]Plant Sci，2007，173（1）：12

[20]Ducaiová Z， Sajko M， Mihalicová S， et al Dynamics of accumulation of coumarinrelated compounds in leaves of Matricaria chamomilla after methyl jasmonate elicitation[J]Plant Growth Regul，2015，79（1）：1

[21]Shi J， Ma C Y， Qi D D， et al Transcriptional responses and flavor volatiles biosynthesis in methyl jasmonatetreated tea leaves[J]Bmc Plant Biol，2015，15（1）：1

[22]步達，姚晓，刘晓艺，等 不同激素配比对明党参叶片愈伤组织诱导的影响及其总香豆素含量的测定[J] 中国药房，2013，24（19）：1806

[23]王艳 钙离子在SA和MeJA诱导白桦三萜合成中的作用及机制[D]哈尔滨：东北林业大学，2014

[24]刘华，梅兴园 TTC法测定红豆杉细胞活力[J] 植物生理学通讯，2001，37（6）：537

[25]蔡庆生 植物生理学实验[M]北京：中国农业大学出版社，2013

[26]桂连友，刘树生，陈宗懋 外源茉莉酸和茉莉酸甲酯诱导植物抗虫作用及其机理[J] 昆虫学报，2004，47（4）：507