人CD133基因及蛋白分子生物学研究进展

唐楠，雷德强，赵洪洋

·综述·

人CD133基因及蛋白分子生物学研究进展

唐楠，雷德强，赵洪洋

Prominin-1是五次跨膜糖蛋白家族两大成员之一。Prominin-1于1997年从小鼠神经上皮干细胞中分离，因为它只位于细胞膜上突出的位置故名priminin，为“突出”之意。同年，细胞表面抗原AC133基于AC133单克隆抗体的使用被发现，且是人类发现的首个五次跨膜蛋白，而且人AC133实际上是小鼠Prominin-1的人同源蛋白，同源性达60%。该蛋白在2000年第七届国际白细胞分化抗原工作组会议(mDAW)上被正式命名为CD133，AC133仅作为表位的名称来使用。

1 CD133蛋白及其分布

CD133蛋白是人类发现的首个五次跨膜蛋白，分子量约为96.8kD，是一个由大约850个氨基酸组成的单肽链，起于胞外的N端，含五个跨膜结构域，两个巨大的胞外环，两端较小的胞内环，终于胞内的C端。并且在两个胞外环上各发现了4个潜在的糖基化位点。AC133单克隆抗体可能识别的就是某个被糖基化的表位，而且被糖基化后蛋白分子的分子量会增加20kD左右。故进行western blot时最后被AC133识别的CD133的条带的分子量为120kD左右，即AC133抗原是一个相对分子量为120kD的糖基化蛋白。

CD133表达于多种组织的干细胞及前体细胞，如造血干细胞，神经干细胞等；近年来越来越多的研究发现在人类多种肿瘤中存在CD133+肿瘤干细胞，如胶质瘤、室管膜瘤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌、喉癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌及骨肉瘤等。

2 CD133基因及其表达的调节

人CD133基因位于4号染色体短臂1区5带3亚带2次亚带(4p15.32)(NCBI gene 8842)，包含至少37个外显子，超过150kb长度，并由5个启动子控制其转录，属于复杂性转录单位，即从一个基因转录时会产生几种不同的成熟mRNA 。

CD133基因表达的调节主要位于转录起始处的调控，比如启动子甲基化及组织特异性的启动子活化，和转录后的调控，主要指不同组织中存在不同的CD133mRNA剪接变体。在翻译水平的调控目前研究尚不多。

2.1 CD133的转录前调控 CD133的转录起始由5个启动子控制并受甲基化和组蛋白去乙酰化调节。CD133基因5端有5个串联的启动子(P1、P2、P3、P4和P5)，在这些启动子中都缺乏TATA盒并且其中3个(P1、P2和P3)位于CpG岛中。而且，在体外实验中P1和P2的甲基化可导致其失活。对其5端UTR的分析显示这些它们的表达呈现组织特异性。例如：肝、肾、胰腺、胎盘、结肠可以同时检测到表达外显子1A和外显子1B的mRNA；在脑、卵巢、婴儿肝和小肠中只能检测到表达外显子1B的mRNA；而表达外显子1D的mRNA仅能在睾丸中检测到。由不同启动子启动的转录具有不同的转录起始点，而公用第二外显子。

关于启动子甲基化在调节CD133基因表达中的作用颇有争议，在不同组织和细胞系中结果不尽相同。You等在一些结直肠癌的细胞系中证明了CpG岛中启动子的过度甲基化会导致CD133转录水平的抑制，而去甲基化可恢复大部分细胞系中CD133的表达，子宫内膜癌的原代培养实验中也有类似结果。而Davide[1]等人认为DNA甲基化对于CD133表达的调节作用仅限于细胞系，在良性和恶性的前列腺的原代培养中CD133的调节并不依赖于DNA甲基化而依赖于染色质凝聚的动力学控制。近来又有实验证据表明在卵巢癌细胞中CD133的表达是同时受甲基化调节和组蛋白去乙酰化修饰调节。

2.2 CD133的转录后调控 继1997年发现AC133分子(现称为CD133)以来，2002又发现了AC133-2。与AC133-1一样，CD133-2也可以被AC133的单克隆抗体识别，不同的是剪接方式，AC133-2的mRNA比AC133-1的mRNA少了外显子3，少了27个核苷酸，因此编码的蛋白仅有856个氨基酸，与AC133-1相比胞外的N端少了9个氨基酸。它们在人体不同组织中的分布不同，在人不同生长发育阶段分布也不同。迄今为止被发现的CD133基因的剪接变体共有7种，为减少混淆统一认识，2007年Fargeas CA将它们以s为前缀冠名，根据成熟mRNA中外显子3、9、19、25、26a/b、27和28的存在于否分别命名为s1、s2、s7、s9、s10、s11和s12[2]。不同的剪接方式最终影响的是开放性阅读框，进而影响蛋白的氨基酸序列。不同的剪接变体之间除了外显子3的存在与否，与其关联的是胞外N端9个氨基酸的存在与否，其他的外显子25、26、27、28的存在与否均影响的是胞内的C端，进而可能影响的是与不同的胞内蛋白相互作用。虽然关于CD133分子胞内作用的信息和研究并不多但是仍然有一些有趣的发现。其他物种的CD133s3、s4、s5的C端末尾几个氨基酸可能是Ⅱ类PDZ结合域配体，人类中存在的CD133s9的C端可能与Ⅲ类PDZ结合域配体相关，CD133s1、s2、s7、s8和s11的C端可能与Ⅰ类PDZ结合域配体有关[2]。

关于CD133分子的糖基化还有很多问题需要研究。确实在不同的发育阶段以及不同的组织会有未被糖基化的CD133分子表达，但是糖基化的的调节尚不明了，但是有实验证明胞外环的N-糖基化有助于AC133表位的表达和识别。目前已开发出针对两种不同的糖基化表位AC133和AC141的单克隆抗体，并广泛应用于CD133表达的检测。

2.3 其他调节 另外在肝癌细胞中CD133的表达还可能接受转化生长因子β(Transforming Growth Factor β，TGF-β)的调节，TGF-β通过抑制DNA甲基化转移酶1(DNAmethyltransferase 1，DNMT1)和DNA甲基化转移酶3β(DNAmethyltransferase 3-β，DNMT3-β)表达来使CpG岛上的P1去甲基化从而上调CD133的表达，这个过程是Smads途径依赖的，即TGF-β受体被TGF-β激活后，Smad2和Smad3被磷酸化并结合成异源性二聚体，继而转位至细胞核内调节下游基因转录[3]。

Fukamachi等[4]最近的实验数据表明，在胃肿瘤细胞系中SOX17的表达与CD133的表达相关，而前者是维持自我更新能力和干细胞特性的重要转录因子，增强表达S0X17能导致CD133表达的增强，而用用RNA干扰技术减少SOX17的表达，发现CD133的表达随SOX17表达的减少而减少，证明SOX17可能是控制CD133表达的关键转录因子。

Campo等[5]发现在表达AC133表位的胶质瘤细胞系中，氧分压水平可能影响AC133表位的表达甚至CD133基因的转录翻译。在缺氧参与的CD133表达调节中，缺氧诱导因子(hypoxia induced factor α，HIF-α)及SOX2起调节转录作用[6]。

另外，Notch信号、Ras/ MEK/ERK信号通路和mTOR信号被阻断时CD133表达下调及上调，证明可能CD133可能也是notch、Ras/ MEK/ERK、mTOR信号的下游基因[7]。

3 CD133相关生物学功能及其展望

尽管CD133被广泛认为是各种组织干细胞及肿瘤干细胞的细胞膜表面标记物并被用于干细胞的分离，尽管它的具体生物学功能并不清楚，但是若其功能缺失将导致视网膜变性和骨骼肌萎缩。输入从血液中分离的CD133+细胞可以治疗肌萎缩，而且CD133+的骨髓干细胞移植有望改善移植效果，且提高梗死心肌的功能[7]。鉴于CD133有以下特点：总是位于细胞突起处，与膜小体和胆固醇膜蛋白有关，一些不同剪接变体具有不同的胞内C端等，基于目前对CD133结构的分布及其他相关的研究推测CD133可能具有以下功能。

3.1 调节细胞增殖及分化[8-9]实验表明在多种组织及细胞系中CD133+的细胞具有更强的致瘤性和转移能力，提示在这些组织及细胞系中CD133可能是一个很有用的干细胞标记物。CD133之所以能维持干细胞自我更新及增殖能力，可能是通过调节某些信号通路如p38MAPK及P13k/Akt途径、NOTCH信号影响下游基因的表达，从而抑制细胞的分化。因CD133剪接变体分布存在组织特异性，以及在发育的不同阶段同一器官可能转录出两种不同的CD133mRNA，提示CD133可能在细胞的分化中起重大作用。

3.2 参与神经髓鞘形成[10]虽然对于人的CD133与髓鞘形成的关系目前尚无报道但在对小鼠CD133分布研究中发现，CD133仅位于神经系统中的髓鞘，而且在髓鞘缺失的小鼠中CD133的表达大大降低以至低于检测下限。因为髓鞘富含脂质，尤其是胆固醇、鞘糖脂、半乳糖脑苷脂以及半乳糖硫酸脑苷脂，CD133可能为胶质细胞的质膜生长提供脂质机构，尤其是膜胆固醇，而后者是CD133的交互作用分子。或者CD133可能是作为一类新的粘附分子，用它两个巨大的胞外糖基化环通过嗜同或是嗜异的交互作用在髓鞘紧缩或轴突形成中起重要作用。

3.3 参与糖、铁代谢调节和细胞骨架改变[11]一篇2007年的论文表明不仅高糖培养能上调CD133的表达并降低其磷酸化程度，而且超量的表达CD133能够促进细胞摄入葡萄糖，在MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells,MDCK细胞)中表达CD133能够明显改变其形态学和促进其迁移能力。尚有报道CD133参与摄入转铁蛋白以及铁代谢。

3.4 参与信号转导[2]虽然关于CD133胞内作用分子目前尚无研究，但是不同的剪接变体之间胞内C端的差异着实可能与胞内信号有关，例如s3、s4和s5变体C端末位的4个氨基酸，HFTL符合PDZ第二类结构域配体的结构特点，尽管这几种变体在人类中并不存在；s9变体在人体中存在，其C端末尾4个氨基酸为SVQC符合第三类PDZ结构域配体的特点，而s1、s2、s7和s11在人体中均存在，它们C端的末4位氨基酸符合第二类PDZ结构域配体的结构特点，虽然CD133也就是Prominin-1在胞内蛋白相互作用上尚无重大发现，但是与它同是五次跨膜蛋白家族的另一成员Prominin-2被证实能与一类新发现的谷氨酸受体交互蛋白结合，而后者具有PDZ结合域。但CD133是否与含有PDZ结合域的蛋白相互作用还有待进一步证实。

3.5 参与肿瘤细胞抗药性调节[12]过表达CD133的C6胶质瘤细胞能够抵抗化疗药诱导的细胞凋亡，并且上调ATP结合盒转运蛋白的表达，而后者常通过主动转运方式参与肿瘤细胞耐药机制。CD133可能通过PI3K-Akt-NF-κB信号通路调节多重耐药基因(multidrug resistant gene 1 ，MDR1)的表达，并诱导胶质瘤对化疗药物的抵抗；CD133靶向治疗可增强胶质瘤的化疗疗效[13-14]。

4 与CD133相关的临床应用

CD133在其在胶质瘤的高表达常提示胶质瘤的不良预后，尤其对于高级别胶质瘤更是如此，P2启动子低甲基化导致CD133超表达可能与胶质瘤复发相关[15-18]。CD133靶向治疗可增强胶质瘤的化疗疗效，靶向CD133的相关信号通路如EGFR通路、细胞自噬通路可改善相关肿瘤的治疗效果[19-20]。

5 展 望

尽管人们对于CD133功能有以上猜测，但实际上对其功能的研究尚待进一步探讨。例如根据目前的研究发现CD133+的细胞较CD133-的细胞具有更强的增殖及自我更新能力，以及可能通过p38MAPK及P13k/Akt途径调节在NB细胞系及原代胶质瘤细胞中调节细胞分化。但CD133促进细胞增殖、调节细胞分化以及肿瘤细胞抗药性的机制目前尚不清楚，CD133的配体也尚未找到，而且CD133基因上游调控通路及下游作用通路还不太明确，启动子活化以及mRNA剪接的机制也不明了，以及对于CD133蛋白合成后被转运至细胞突出部位的机制了解也很少，CD133为何呈现组织特异性表达，故关于CD133还有很多问题待探讨。本文就CD133蛋白的结构、表达调控，生物功能及临床相关应用进行了综述，若上述问题得到明确解答，干细胞移植，神经及其他组织再生，肿瘤的基因治疗和化学治疗将会获得重大突破。

[1] Jászai J,Fargeas CA,Florek M,etal.Focus on molecules:Prominin-1 (CD133)[J].Exp Eye Res,2007,85:585.

[2] Shmelkov SV,Jun L,St Clair R,etal.Alternative promoters regulate transcription of the gene that encodes stem cell surface protein AC133[J].Blood,2004,103:2055.

[3] Jeon YK,Kim SH,Choi SH,etal.Promoter hypermethylation and loss of CD133 gene expression in colorectal cancers[J].World Journal of Gastroenterology,2010,16:3153.

[4] Friel AM,Zhang L,Curley MD,etal.Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells[J].Reprod Biol Endocrinol,2010,8:147.

[5] Pellacani D,Packer RJ,Frame FM,etal.Regulation of the stem cell marker CD133 is Independent of promoter hypermethylation in human epithelial differentiation and cancer[J].Mol Cancer,2011,10:94.

[6] Yu Y,Flint A,Dvorin EL,etal.AC133-2,a novel isoform of human AC133 stem cell antigen[J].J Biol Chem,2002,277:20711.

[7] Mak AB,Blakely KM,Williams RA,etal.CD133 N-glycosylation processing contributes to cell-surface recognition of the primitive cell marker AC133[J].J Biol Chem,2011,286:41046.

[8] You H,Ding W,Rountree CB.Epigenetic regulation of cancer stem cell marker CD133 by transforming growth factor-beta[J].Hepatology,2010,51:1635.

[9] Fukamachi H,Shimada S,Ito K,etal.CD133 is a marker of gland-forming cells in gastric tumors and Sox17 is involved in its regulation[J].Cancer Sci,2011,102:1313.

[10] Herold-Mende C,Campos B,Zeng L,etal.Expression and regulation of AC133 and CD133 in glioblastoma[J].Eur J Cancer,2011,47:S577.

[11] Matsumoto K,Arao T,Tanaka K,etal.mTOR signal and hypoxia-inducible factor-1 alpha regulate CD133 expression in cancer cells[J].Cancer Res,2009,69:7160.

[12] Fan X,Khaki L,Zhu TS,etal.NOTCH pathway blockade depletes CD133-positive glioblastoma cells and inhibits growth of tumor neurospheres and xenografts[J].Stem Cells,2010,28:5.

[13] Xi G,Li YD,Grahovac G,etal.Targeting CD133 improves chemotherapeutic efficacy of recurrent pediatric pilocytic astrocytoma following prolonged chemotherapy[J].Mol Cancer,2017,16:21.

[14] Xi G,Hayes E,Lewis R,etal.CD133 and DNA-PK regulate MDR1 via thePI3K- or Akt-NF-κB pathway in multidrug-resistant glioblastoma cells in vitro[J].Oncogene,2016,35:241.

[15] Kazama S,Kishikawa J,Kiyomatsu T,etal.Expression of the stem cell marker CD133 is related to tumor development in colorectal carcinogenesis[J].Asian Journal of Surgery,2017,12.:5576.

[16] Fathi A,Mosaad H,Hussein S,etal.Prognostic significance of CD133 and ezrin expression in colorectal carcinoma[J].IUBMB Life,2017,69:328.

[17] Wu B,Sun C,Feng F,etal.Do relevant markers of cancer stem cells CD133 and Nestin indicate a poor prognosis in glioma patients? A systematic review and meta-analysis[J].J Exp Clin Cancer Res,2015,34:44.

[18] Sun B,Wan Z,Shen J,etal.DNA hypomethylation of CD133 promoter is associated with recurrent glioma[J].Oncol Rep,2016,36:1062.

[19] Jang JW,Song Y,Kim SH,etal.CD133 confers cancer stem-like cell properties by stabilizing EGFR-AKT signaling in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2017,389:1.

[20] Sun H,Zhang M,Cheng K,etal.Resistance of glioma cells to nutrient-deprived microenvironment can be enhanced by CD133-mediated autophagy[J].Oncotarget,2016,7:76238.

(收稿2017-01-04 修回2017-03-12)

国家自然科学基金(81301051)

430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科

雷德强

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.04.021

R730.2

A

1672-7770(2017)04-0318-03