宫衣净酊中盐酸水苏碱HPLC-ELSD测定方法的建立

朱永刚，王 磊，崔东安，王旭荣，张景艳，张 凯，张 康，王学智，杨志强，李建喜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050)

宫衣净酊中盐酸水苏碱HPLC-ELSD测定方法的建立

朱永刚，王 磊，崔东安，王旭荣，张景艳，张 凯，张 康，王学智，杨志强，李建喜*

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050)

为了建立宫衣净酊中盐酸水苏碱的HPLC测定方法，采用的色谱条件为色谱柱为赛分Sepax polar-propylamide(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-2 mL/L的冰醋酸(65∶35)，流速为0.5 mL/min，进样量10 μL，柱温为30℃。检测器参数为飘逸管温度为105℃，雾化室的温度为60℃，载气体积流量为1.0 mL/min。结果表明，在此色谱条件下，盐酸水苏碱的线性范围0.155 mg/mL～248.00 mg/mL(R2=0.999 9，n=6)，平均回收率为95.46% (RSD=1.08%)。说明本方法简便、准确、重现性好，可以作为宫衣净酊的质量控制方法。

高效液相色谱；蒸发光散射检测器；宫衣净酊；盐酸水苏碱；含量测定

宫衣净酊是由益母草、红花、葛根等中药制成的酊剂，其临床功效主要有活血化淤、促进胎衣排出、净化子宫、加快产后子宫复旧、促进产后繁殖性能的恢复。前期试验证实，宫衣净酊具有治疗奶牛胎衣不下的效果，预防奶牛胎衣不下有效率达95%，治愈率达85.7%[1-2]。益母草为唇形科植物益母草的干燥地上部分，具有活血通经、利尿消肿等功效。盐酸水苏碱是益母草的主要成分之一，由于其性质稳定。因此，选用盐酸水苏碱作为宫衣净酊有效成分的含量控制指标之一。《中国兽药典》(2010年版)中录入了益母草中盐酸水苏碱的HPLC含量测定方法[3]，由于宫衣净酊是中药复方酊剂，成分较多，故该方法不适宜于宫衣净酊中盐酸水苏碱的含量测定。盐酸水苏碱的检测方法有雷氏盐剩余比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法(使用紫外检测器)等[4-8]。雷氏盐剩余比色法的缺点是操作繁琐，误差较大, 不适用于成分复杂的中成药;而薄层扫描法的缺点是重现性和灵敏度较差;盐酸水苏碱属于季铵盐型生物碱, 仅在末端有紫外吸收, 因而采用紫外-高效液相色谱法其它成分对其测定有很大的干扰[9]。蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector ,ELSD)是一种新型的通用型质量检测器，能检测任何挥发性低于流动相的化合物，特别是无特征紫外吸收或紫外末端吸收的物质，与紫外检测器、质谱检测器和核磁共振检测器等用于检测自然界中的所有物质，特别是在中药分析中有很广泛的应用[4,10]。为更好的控制该酊剂的质量，确保临床疗效，本文采用HPLC-ELSD方法对宫衣净酊中的盐酸水苏碱进行含量测定，以期为宫衣净酊的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 高效液相色谱仪，美国Dionex公司产品；赛分Sepax polar-propylamide色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国赛分科技公司产品；超声波清洗器KQ-250型，昆山市超声仪有限公司产品；超纯水制备仪，力康公司产品；ME235S微量分析天平，Sartorius公司产品；Agilent bond elut scx 固相萃取小柱,美国安捷伦科技公司产品。

1.1.2 药品 盐酸水苏碱对照品，中国食品药品检定研究所，批号为110752-201313；宫衣净酊样品，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃省中兽药工程技术研究中心研制，主要由益母草、红花、葛根等药组成，每瓶200 mL；乙腈，Fisher Scientific公司产品，色谱纯；纯化水自制；乙醇为分析纯；冰醋酸，Macklin公司产品，色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为赛分Sepax polar-propylamide(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃；流动相：流动相为乙腈-2 mL/L的冰醋酸(65∶35)，流速为0.5 mL/min，进样量10 μL。检测器参数：飘逸管温度为105 ℃，雾化室的温度为60 ℃，载气体积流量为1.0 mL/min。在上述色谱条件下，盐酸水苏碱的典型保留时间为18.9 min，理论塔板数以盐酸水苏碱峰计算不低于6 000。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸水苏碱对照品5 mg，用适量700 mL/L乙醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，加700 mL/L乙醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密量取宫衣净酊样品溶液2 mL，用稀盐酸溶液调节pH至1～2，取Agilent bond elut scx固相萃取小柱，依次用甲醇、400 mL/L乙醇各2 mL活化，将酸化后的样品过柱；依次用超纯水6 mL淋洗；甲醇/氨水(30/70)15 mL洗脱。洗脱液蒸干，加700 mL/L乙醇溶解，转移到5 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 阴性对照溶液的制备 取处方中不含益母草药材的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.5 方法专属性试验 按照1.2.1所述色谱条件，分别取宫衣净酊供试品溶液、阴性溶液以及盐酸水苏碱对照品溶液进行HPLC分析。

1.2.6 标准曲线的绘制 精密量取盐酸水苏碱对照品溶液，分别制备成0.155、0.31、0.62、1.24、2.48 mg/mL的浓度梯度对照品溶液。按照1.2.1所述色谱条件，取上述盐酸水苏碱标准品溶液进行HPLC分析，以峰面积y相对应的标准品溶液浓度x进行线性回归分析，绘制标准曲线。

1.2.7 精密度试验 取同一宫衣净酊供试品溶液，重复进样6次，按照1.2.1所述色谱条件，测定其峰面积。

1.2.8 稳定性试验 取同一宫衣净酊供试品溶液，室温放置，于0、2、4、8、12、24 h进样，按照1.2.1所述色谱条件，测定盐酸水苏碱含量。

1.2.9 重复性试验 取同一批宫衣净酊供试品溶液，按照供试品制备方法平行制备6份，按照1.2.1所述色谱条件测定盐酸水苏碱含量。

1.2.10 加样回收率试验 精密量取同一批次已知含量的宫衣净酊样品溶液6份，每份2 mL，分别加入与样品所含盐酸水苏碱量相当的对照品，摇匀。按制备供试品溶液的方法制备，并测定其含量，计算回收率。

回收率=(实测值-供试品中盐酸水苏碱含量)/对照品盐酸水苏碱加入量×100%。

1.2.11 样品含量的计算方法 按标准曲线计算样品中盐酸水苏碱含量的公式：X=C/V

X为样品中盐酸水苏碱的含量(mg)；C为样品中色谱峰的面积积分值对应的盐酸水苏碱的浓度(mg/mL);V为样品的体积(mL)。

2 结果

2.1 盐酸水苏碱含量测定的标准曲线

盐酸水苏碱线性回归方程：y=0.237 2x-22.114 (R2=0.999 9，n=6)，结果如图1所示。盐酸水苏碱在18.25 μg～584.00 μg范围内呈良好的线性关系。

图1 盐酸水苏碱的标准曲线

2.2 精密度试验

测定6份同一批次的宫衣净酊样品中盐酸水苏碱含量，其RSD为0.88%(n=6)，结果表明精密度良好。

2.3 稳定性试验

宫衣净酊样品分别在0、2、4、8、12 h进样，盐酸水苏碱含量的RSD为0.87%(n=6)，表明宫衣净酊供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

2.4 重复性试验

选取6个不同批次的宫衣净酊样品进行测定，宫衣净酊中盐酸水苏碱含量的RSD为0.89%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.5 加样回收率试验

宫衣净酊中盐酸水苏碱的平均回收率为95.46%，RSD为1.08%(表1)，表明本试验具有良好的回收率。

2.6 系统适应性试验

结果显示在该色谱条件下，其他成分不干扰盐酸水苏碱的测定，可与其他成分达到基线分离(图2)。

表1 盐酸水苏碱加样回收试验结果 (n=6)

A.宫衣净酊阴性样品; B.盐酸水苏碱标准品; C.宫衣净酊供试品A.Negative sample of Gong-Yi-Jing tincture; B.Standard sample of stachydrine hydrochloride; C.Sample of Gong-Yi-Jing tincture

3 讨论

3.1 检测器的选择

盐酸水苏碱属于季铵碱，结构中无共轭体系。因此，对紫外吸收非常弱，通过对盐酸水苏碱进行紫外光谱扫描，盐酸水苏碱仅在紫外末端有吸收，其最大吸收波长为192.4 nm[9]。紫外检测器检验具有末端吸收的物质要求被检测物质纯度高、干扰少。但由于宫衣净酊是中药复方酊剂，成分复杂，若采用紫外-可见光检测器，干扰较大，且流动相的溶剂末端吸收也会带来较大的干扰。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种新型的通用型质量检测器，与紫外检测器、质谱检测器和核磁共振检测器等用于检测自然界中的所有物质，特别是在中药分析中有很广泛的应用。由于中药的化学成分较为复杂，部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收，加上色谱的分离困难以及流动相的干扰，使用传统的紫外检测器对其进行定量十分困难，而ELSD弥补了紫外检测器这方面的不足，被广泛的应用于生物碱类成分、皂苷类成分、糖类成分的分析，并取得了不错的效果[4,10-11]。故本试验采用通用型蒸发光散射检测器[4]，通过对雾化器温度、漂移管温度、气体流速等各种检测器参数进行优化，得到最佳峰形和最大信噪比。试验结果显示，本方法适合用于宫衣净酊中盐酸水苏碱的定量检测。

3.2 色谱柱和流动相的选择

由于盐酸水苏碱属于强极性的酸碱两性小分子化合物，很难在C18柱中进行保留，不适用于宫衣净酊这种中药复方酊剂的含量测定。故本试验改用益母草专用柱进行盐酸水苏碱的分析。采用HPLC法测定中药复方制剂中的盐酸水苏碱，流动相系统的选择有不同组成，为了得到较好的色谱图和适宜的保留时间，本试验比较了不同流动相分离的效果，如乙腈∶水(90∶10)(85∶15)[12-13]，均未能与杂质峰达到基线分离，而当选择乙腈-2 mL/L冰醋酸(35∶65)作为流动相系统时，盐酸水苏碱在18 min～21 min之间出峰，并与杂质峰能达到基线分离，分离效果好，保留时间适中，故选其作为流动相。

3.3 提取方法的选择

由于宫衣净酊是由多种中药复方构成，样品溶液中所含杂质很多，如果不通过净化处理而进行直接分析液相色谱分析，会造成杂质峰过多，且会严重影响色谱柱的使用寿命。因此《中国兽药典》中700 mL/L乙醇直接提取盐酸水苏碱的供试品溶液制备方法并不适用于宫衣净酊样品中盐酸水苏碱的提取。本试验对以下3种方法进行比较:①中性氧化铝法；②雷氏铵盐法；③Agilent bond elut scx固相萃取法[14-15]。结果表明,方法③操作简单，提取的盐酸水苏碱含量高，并且能够达到基线分离。有文献报道用甲醇提取盐酸水苏碱效果最好[9]，本试验对供试品溶液提取方法进行比较，结果表明，甲醇提取的盐酸水苏碱未能达到基线分离，而700 mL/L乙醇能够达到基线分离，故最终采用700 mL/L乙醇为供试品提取溶剂。

综上所述，本试验所采用的HPLC-ELSD法在测定宫衣净酊中盐酸水酸碱的含量，专属性强、相关性好、重现性好、准确度高，是测定宫衣净酊成分含量的有效方法，为宫衣净酊中盐酸水苏碱含量测定的应用研究提供了可靠依据。

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Establishement of HPLC-ELSD Assay for Determination of Stachydrine Hydrochloride Content in Gong-Yi-Jing Tincture

ZHU Yong-gang，WANG Lei，CUI Dong-an，WANG Xu-rong，ZHANG Jing-yan，ZHANG Kai,ZHANG Kang,WANG Xue-zhi,YANG Zhi-qiang，LI Jian-xi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050，China)

In order to establish an HPLC method for the determination of stachydrine hydrochloride in Gong-Yi-Jing tincture,Sepax polar-propylamide column(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used.The mobile phase of acetonitrile to 2 mL/L glacial acetic acid (35∶65)and flow rate of 0.5 mL/min were set,the injection volume is 10 μL.The column temperature is 30℃.The detector parameters:the evaporation temperature is 105 ℃,the nebulizer temperature is 60 ℃,the flow rate is 1.0 mL/min.The results showed that,in these chromatographic conditions,the liner range of stachydrine hydrochloride was 0.155 mg/mL-248.00 mg/mL (r=0.999 9,n=6),the average recovery was 95.46%(R=1.08%,n=6).The HPLC method is repeatable,sensitive,and accurate,and can be used for quality control of Gong-Yi-Jing tincture.

HPLC; ELSD; Gong-Yi-Jing tincture; stachydrine hydrochloride; content determination

2016-07-03

公益性行业(农业)科研专项项目(201303040)

朱永刚(1991-)，男，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事奶牛中兽药研发。*通讯作者

S859.799.1

A

1007-5038(2017)02-0060-04