蛋源大肠埃希菌的分离鉴定及毒力基因和耐药基因检测

吴海滨，杨 娟，黄 超，周杰珑，吴培福

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224)

蛋源大肠埃希菌的分离鉴定及毒力基因和耐药基因检测

吴海滨，杨 娟，黄 超，周杰珑，吴培福*

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224)

为了调查鸡蛋中大肠埃希菌的感染情况，为生产实践提供参考，从昆明市区鸡蛋中分离出了3株大肠埃希菌，并对其毒力基因、耐药基因、动物致病性及药物敏感性进行了研究。结果表明，菌株KM1携带的毒力基因检出率75%，耐药基因检出率77.3%；菌株KM2携带的毒力基因和耐药基因检出率居中；菌株KM3毒力基因检出率91.7%，耐药性基因检出率50%。动物毒力检测结果KM1为不致病菌株，KM2为低致病菌株，KM3为中度致病菌株。药敏试验结果显示，分离菌株对头孢噻肟、头孢曲松钠敏感，对庆大霉素、氨苄西林等具有不同程度的耐药性。中草药对3株大肠埃希菌的抑制效果各有所不同，相比之下连翘与松针的效果较好。本试验为研究昆明市区鸡蛋中大肠埃希菌污染与防控提供了理论依据。

蛋源大肠埃希菌；毒力基因；耐药基因；中草药

致病性大肠埃希菌可通过感染鸡的卵巢、输卵管或粪便等途径而污染种蛋，并侵入种蛋内繁殖，致使种蛋孵化率下降、死胚增多，弱雏、雏鸡病死率增加等问题，引发雏鸡发生大肠杆菌感染，给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。此外，鸡蛋大肠埃希菌污染具有重要的公共卫生学意义，蛋源大肠埃希菌的致病性和人们的健康紧密相关，会对人体健康造成较大的危害[1]。研究表明，大肠埃希菌极易产生耐药性[2]，且其耐药谱越来越宽，对许多抗生素产生了耐药性，甚至对未使用的新药也有耐药性。为此，分离鉴定蛋源大肠埃希菌，并对分离株的耐药性、致病性及新型抗菌药物筛选的研究具有重要的理论和实践意义。统计表明，鸡大肠杆菌病是云南省养鸡业的头号细菌病之一，而蛋源大肠埃希菌的研究文献较少。本研究从昆明市及周边地区农贸市场采集鸡蛋，并从中分离鉴定大肠埃希菌，对其生物学特性进行了研究，为种鸡场鸡大肠杆菌感染的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鸡蛋 鸡蛋80枚，购自昆明市及周边地区各农贸市场。

1.1.2 培养基 营养肉汤(实验室配制)；伊红美蓝(EMB)培养基，青岛科技园海博生物科技有限公司产品；MH肉汤培养基，北京奥博星生物科技有限公司产品。

1.1.3 中草药 大黄、黄柏、金银花、连翘，购自昆明市盘龙区社区医院。松针采集于西南林业大学后山。

1.1.4 抗菌药物 氨苄西林钠、左氧氟沙星、头孢曲松钠、头孢拉定、头孢噻肟钠、阿莫西林钠舒巴坦、硫酸庆大霉素，均购于云南宏源药业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 接种培养 参照文献[3-5]，在无菌条件下取蛋内容物置于无菌50 mL离心管内，混匀，而后吸取1 mL蛋液置于另一无菌离心管中，加入9 mL肉汤培养基稀释，用漩涡混合器充分混匀，最后将稀释蛋液用肉汤培养基进行10倍倍比稀释至103，于37℃条件下培养48 h。将上述培养物接种于EMB琼脂平板上，37℃倒置培养24 h～48 h，置-20℃保存可疑菌落，以待鉴定。

1.2.2 生化特性鉴定 采用常规技术来鉴定分离菌株，包括糖发酵试验(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇)、吲哚试验、明胶试验、枸橼酸盐利用试验、硫化氢试验、MR和VP试验。

1.2.3 动物致病性试验 将12只昆明小鼠随机分成4组：A组、B组、C组和D组，每组3只。A组为对照组，通过腹腔接种0.2 mL营养肉汤培养基；B组、C组和D组分别接种0.2 mL的不同菌液(接种浓度为107CFU/mL)。观察试验鼠的临床表现，并做记录。结果判断参照文献[6]。

1.2.4 抗菌药物体外抑菌试验 采用微量稀释法检测分离株的药物敏感性。用无菌生理盐水将氨苄西林钠、左氧氟沙星、头孢曲松钠、头孢拉定、头孢噻肟钠、阿莫西林钠舒巴坦、硫酸庆大霉素稀释成1 024 μg/mL的溶液，置-20℃保存备用。

参照CLSI标准，将2个酶标板并列，1列～15列各孔中加入100 μL MH肉汤培养基，而后，第1列加入1 024 μg/mL的抗生素100 μL，进行2倍倍比稀释至213，每种抗生素设3个平行和1个空白对照。最后1～14列各孔加100 μL 105CFU/mL的菌液，留置第15列孔作为空白对照。37℃培养24 h，观察酶标板各孔的浑浊度，判断结果。

1.2.5 毒力基因检测 用煮沸法提取分离株基因组DNA，扩增条件参照下列文献。

参照文献[7-8]合成毒力基因引物(表1)。包括cvaC、feoB、fimA、fyuA、iroN、irp-2、iss、iucC、iutA、papC、traT和tsh。

表1 PCR扩增的毒力基因引物

1.2.6 耐药基因 检测参照文献[9-10]来合耐药基因引物(表2)。磺胺类耐药基因包括sul1、sul2和sul3；四环素类耐药基因包括tetA和tetB；氨基糖苷类耐药基因包括aacC2、aacC4、aadAl、aadA2、aac(3)-Ia、aac(3)-IIa和aph(3)-IIa；氯霉素类耐药基因包括Catl、CmlA和Flor；β-内酰胺类耐药基因包括CTX-M、SHV、OXA和TEM；其他基因包括Gyra(QRDR)、QnrS和Aac(6，)-Ib-cr。

表2 PCR扩增的耐药基因引物

1.2.7 中草药提取物体外抑菌试验 称取大黄、黄柏、金银花、连翘和松针各50 g，参考文献[11-12]所述方法，通过牛津杯法来研究各药物的体外抑菌效果。测试项目包括体外抑菌圈大小、最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果

2.1 生化鉴定

从采集鸡蛋中共分离到9株可疑菌，通过生化鉴定最终确定其中3株为大肠埃希菌，分别命名为KM1、KM2和KM3。

2.2 毒力基因检测

从表3中可以看出检测12对毒力基因的结果是菌株KM1、KM2和KM3均携带毒力基因，其中检出率为100%的毒力基因包括feoB、fimA、fyuA、iroN、irp-2、iss、iucC、iutA和traT，并未检出cavaC基因。

表3 毒力基因检出率

注：“+”携带，“-”不携带。

Note：“+” Detection，“-”Not detection.

2.3 毒力基因检出数量

从表4中可以看出KM3在3株菌种携带的毒力基因携带率91.7%，其次是KM2携带率83%，最后是KM1携带率75%。

表4 毒力基因检出数量

2.4 动物致病性试验

经统计在腹腔注射48 h后，A组小鼠未死亡，3只全部存活；B组小鼠也全部存活；C组小鼠有1只致死，存活2只；D组小鼠致死2只，存活1只。发病小鼠精神萎靡，不喜走动。剖检结果发现小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺有不同程度的出血症，肠道充气，肠壁变薄。由此表明，KM1菌株不致病，KM2为低致病性菌株，KM3为中致病性菌株。

2.5 耐药基因检测

从表5中看出，100%检出的耐药基因包括sul1、tetA、aacC4、aadA1、aadA2、Cat1、TEM和Gyra(QRDR)，耐药基因SHV和QnrS未检出。

表5 耐药基因检测结果

注：“+”携带，“-”不携带。

Note： "+" Detection，"-"Not detection.

2.6 药敏试验

2.6.1 抗生素体外抑菌试验最小抑菌浓度MIC测定 表6中数据显示3株大肠埃希菌对氨苄西林钠与硫酸庆大霉素的耐药性最高，对头孢噻肟钠、头孢曲松钠敏感。

2.6.2 中草药提取物体外抑菌试验抑菌圈测定 从表7中分析得出中草药对于耐药性高的菌株具有较好的抑制作用，松针提取物对于大肠埃希菌也有抑制效果。

2.6.3 中草药提取物体外抑菌试验MIC与MBC测定 从表8中可以看出中草药提取物对大肠埃希菌的抑制作用，且在抑制效果上各有不同，总体来说，连翘和松针的效果较好，金银花、大黄、黄柏的抑菌效果次之。

表6 抗菌药物对3株大肠埃希菌的最小抑菌浓度MIC

表7 中草药体外抑菌试验效果

3 讨论

从昆明市及周边各农贸市场上采购的80枚鸡蛋共分离鉴定出了3株大肠埃希菌，鸡蛋内容物中大肠埃希菌的携带率为3.75%，普遍比其他地方低。陈国营等[13]检测出90枚鸡蛋内容物中大肠埃希菌的携带率为6.67%，由此可以看出，云南省昆明市及周边地区的鸡蛋安全性较高。

表8 中草药提取物体外抑菌的MIC值与MBC值

致病性研究中发现， KM3菌株携带了11个毒力基因，携带率91.7%，动物致病性试验中致死2只小鼠，KM3菌株为中致病性菌株。KM2和KM1携带毒力基因的个数分别为10和9，KM2菌株致死1只小鼠，KM1菌株并无致死，KM3菌株比其他两株菌多携带了papC和Tsh基因，papC基因编码P菌毛。Kariyawasam等证明Pap操纵子出现于APEC O1菌株的一个毒力岛上，其基因组区域可能与非致病性向致病性的转化相关。温度敏感性血凝素Tsh能黏附红细胞、血色素、外膜纤维连接蛋白和IV胶原等，Tsh可能与APEC的黏附作用有关，也可能与摄铁功能相关。KM3菌株也由于这2个基因致病性比KM2和KM1强。一般情况下，毒力基因携带越多，其致病性越强，现其中2株为致病菌，如KM2和KM3可能对人和动物产生危害。KM1菌株携带毒力基因最少，在动物毒性试验中为不致病菌株。董向磊[11]认为携带iutA、iss、tsh、iroN、irp-2、cvaC这6个基因中2个以上的即为致病菌株。但是也有列外，有3个菌株含iutA、iss、tsh、iroN、irp-2、cvaC这6个毒力基因中的2个或以上是非致病性菌株。本研究中KM1携带了iutA、iss、iroN、irp-2这4个毒力基因，动物毒性试验结果为非致病株，这与董向磊的研究结果相同。之所以出现这种结果，可能在基因间存在拮抗作用。2006年薛俊龙等[14]研究了138株鸡致病性大肠埃希菌的耐药情况，其中庆大霉素耐药率28.2%，阿莫西林耐药率87.0%。本研究发现庆大霉素耐药率为66.7%，阿莫西林钠舒巴坦耐药率33.3%。由此可见，大肠埃希菌对庆大霉素耐药率相比于2006年有明显的增加，阿莫西林钠舒巴坦相比阿莫西林效果更佳。庆大霉素耐药率急速上升可能是盲目用药的后果。

中草药和松针来源广泛，不易产生耐药性，且体外抑制蛋源大肠埃希菌试验中抑菌效果明显。若对其抑菌机制加以研究并优化中草药配伍，增加其抑菌效果，可广泛应用于今后的养殖业，为今后解决蛋源大肠埃希菌感染的问题走出一条新路。但鉴于禽类消化道短，食物在其体内停留时间少，药物的吸收率不高，因此，要利用科技，优化药物生产工艺。要开发出易于禽类吸收的速效药剂，如高效释放剂、超微粉碎剂等提高药物释放速度和释放量，增加药物在禽体内停留时间，增强药效，以预防和治疗大肠埃希菌的感染。

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Identification and Pathogenicity Associated Study ofEscherichiacoliIsolated from Eggs

WU Hai-bin,YANG Juan,HUANG Chao,ZHOU Jie-long,WU Pei-fu

(CollegeofLifeScience,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan,650224,China)

Three strains ofEscherichiacoliwere isolated from eggs in order to investigate the bacterial infection status of eggs in Kunming,and provide the practical reference for egg production.In addition,the associated features of isolated strains were studied,including virulence genes,resistance genes,animal pathogenicity and drug sensitivity test.The results showed that the virulence gene carrying rate of 75% and the resistance gene rate of 77.3% were found in the the strain KM1; the virulence gene rate of 91.7% and the resistance genes rate of 50% were found in the the strain KM3; while,the rate of the KM2 mediated between the KM1 and KM3.The strain KM1 is non-pathogenic,the KM2 is low-pathogenic,and the KM3 is moderately pathogenic.Drug sensitivity test showed that the isolates were sensitive to cefotaxime and ceftriaxone sodium,however,resistant to gentamicin and ampicillin at different levels.The inhibitory effects of Chinese herbal medicine on 3 strains were different.In comparison,theForsythiasuspensaand pine needles had better anti-bacterial effects.The results provided theoretical basis for further investigation and control ofEscherichiacoliin eggs.

Escherichiacoliisolated from eggs; virulence gene; drug resistance gene; Chinese herbal medicine

2016-05-19

云南省优势特色重点学科生物学建设项目(50097505)；云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队(51400605)

吴海滨(1988-)，男，四川通江人，硕士研究生，主要从事动物疫源疫病研究。*通讯作者

S852.6612

A

1007-5038(2017)02-0017-05