一起山羊地方性鼻内肿瘤的诊断

王 景，周 曼，何亚鹏，付明哲，许信刚

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

一起山羊地方性鼻内肿瘤的诊断

王 景△，周 曼△，何亚鹏，付明哲*，许信刚*

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

陕西省某山羊养殖场发生一起山羊鼻内肿瘤病，通过流行病学和临床症状调查、病理剖检、病理切片检查进行初步诊断。其次根据GenBank收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因组序列设计1对特异性引物，通过PCR方法从肿瘤组织中扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明，该目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒高度相似，最终确定该病为山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤(ENT)。

山羊；地方性鼻内肿瘤病毒；病理变化；序列分析

山羊地方性鼻内肿瘤(Enzootic nasal tumor，ENT)是由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goat，ENTV-2)引起的一种慢性、进行性、接触传染性的肿瘤性疾病[1]，被感染山羊主要表现食欲不振、极度消瘦、呼吸困难、运动减少、运动时有大量鼻液流出，最终衰竭而死，病死率高达100%，给养羊业造成了较大的经济损失[2-3]。ENTV感染山羊鼻内黏膜上皮细胞，引起异常增生，最终形成肿瘤[4-5]。国外学者在肿瘤发生机制方面进行了深入研究[6-8]。2015年陕西省某山羊饲养场发现了多起疑似山羊地方性鼻内肿瘤病例，通过临床剖检观察、病理切片检测及ENTV前病毒基因的PCR检测和序列分析，最终确诊为山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 山羊鼻内肿瘤组织材料取自陕西省某山羊养殖场自然感染病例的鼻腔肿瘤组织。

1.1.2 主要试剂 2×EsTaqMasterMix、Super DNA Marker，北京康为世纪生物科技有限公司产品；血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 流行情况及剖检病变 向饲养管理人员了解该病的发生情况，并仔细观察病羊的临床症状。病羊动脉放血致死，进行系统剖检观察，特别是鼻腔及相邻区域的检查，记录眼观病变。

1.2.2 病理学检查 取自然发病山羊的鼻内增生物、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、心脏等组织样品(厚约2 mm～3 mm)置于100 mL/L中性福尔马林液固定24 h～48 h后按照常规方法制作病理切片。

1.2.3 引物设计 根据NCBI上公布的ENTV的全基因序列(AY197548.2和NC-004994.2)，参照文献[3,9-10]，应用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，用于扩增ENTV前病毒基因。上游引物为P1：5′-GTTTTCCTCGCCACTACTCTTG-3′，下游引物P2：5′-TACCCAATAAGCGTCGGATGAT-3′，预期扩增片段大小为2 249 bp，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.4 PCR扩增及序列分析 按照血液、组织、细胞基因组提取试剂盒的方法提取病羊鼻内肿瘤组织中ENTV前病毒的DNA，作为模板进行PCR，另外取2只健康羊鼻内容物作为阴性对照。50 μL PCR反应体系：2×EsTaqMasterMix 25 μL，上、下游引物P1和P2各1 μL，模板3 μL，去离子水20 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环；最后72℃ 8 min。电泳检测有无目的条带，将出现目的条带的PCR产物纯化，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，将测序结果应用NCBI中的Blast工具进行序列相似性比对分析。

2 结果

2.1 流行特点及临床症状

陕西省某山羊养殖基地的舍饲羊群中发现鼻内肿瘤的病羊，最初仅个别山羊发病(发病率不超过5%)，随后发现发病山羊的数量有增加的趋势，初期病羊从鼻内流出稀薄的浆液性鼻液，以后逐渐变成浓稠的鼻液(图1)。随后病羊逐渐出现呼吸困难，不断甩头，并不时发出鼻噻音。部分患病严重的山羊眼球外突，有的甚至发生穿孔，从孔中流出大量分泌物。晚期病羊呼吸困难，食欲废绝，全身消瘦衰竭，最后窒息而死。病羊体温变化不明显，病程长达半年以上。病羊后期多表现出全身性衰竭，窒息而死。

图1 感染ENTV患羊流出黏稠脓性鼻液

2.2 剖检病变

病羊鼻腔内充满浓稠分泌物，单侧鼻道内有淡黄色或者淡粉红色的增生物，似菜花状，质地软，易碎(图2)。羊肺部正常，其他部位均无病变。

A.病羊左侧鼻腔内单侧性肿瘤，几乎占据整个鼻腔(正中矢状面)；B.取出的肿瘤组织；C.肿瘤组织大小A.The unilateral tumor in the left side of nasal cavity of goat,occupying almost the whole of the nasal cavity(median sagittal plane);B.Tumor tissue from the nasal cavity; C.The size of tumor tissue

2.3 病理切片观察

取鼻腔增生物制作病理切片，显微镜下可观察到增生物具有腺瘤的特点，其表面为一层柱状上皮细胞构成的假膜，基质为疏松的结缔组织，其间分布有大量血管。瘤细胞形态基本一致，排列成不规则的腺泡结构，内有较多分泌物(图3A)。乳头状生长的肿瘤细胞呈柱状，细胞核位于基部，间质内巨噬细胞、淋巴细胞浸润(图3B)；深层肿瘤呈腺管(泡)状生长，黏液腺肿瘤范围广泛，腺管内分泌物较多，小血管内可见嗜中性粒细胞(箭头所示)，腺泡基膜间有巨噬细胞浸润(图3C)。其他组织未见明显病理损伤。

2.4 PCR扩增与序列分析

以提取的鼻腔瘤组织细胞基因组DNA(含有整合进去的前病毒DNA)为模板，PCR扩增得到2 249 bp的片段，而正常羊样品没有目的条带出现，与预期一致(图4)，将序列上传至NCBI，登录号为KU179192.1。与NCBI已报道3株ENTV-2核苷酸序列比较发现，与ENTV-SC株HM104174.1同源性为99%，与国外2株AY197548.2和NC-004994.2同源性均为90%，片段中包含的gag基因与其他3株ENTV-2(HM104174.1，AY197548.2，NC-004994.2)同源性在92.5%以上，因而从核酸水平证实了这起山羊地方性鼻内腺瘤是由ENTV引起的。

A.表层肿瘤呈乳头状生长(40×)；B.乳头状生长的肿瘤细胞(100×)；C.深层肿瘤呈腺管(泡)状生长(400×)A.The surface of tumor growth like papillary tumor(40×); B.Papillary tumor cells(100×); C.The deep of tumor growth like glandular tube (acinus)(400×)

M. DNA标准DL 2 000；1.ENA患羊PCR结果；2～3.阴性对照
M.DNA Marker DL 2 000 ;1.PCR result of goat with ENA; 2-3.Negative control

图4 PCR结果
Fig.4 Result of PCR

3 讨论

山羊地方性鼻内肿瘤的病例在国内报道的不多，1984年刘凤翔、林曦等[11-12]对内蒙古地区的ENT的发病山羊的临床症状和病理学进行了详细的研究。2006在湖南某羊场山羊鼻内肿瘤的发生呈地方流行性[13]。2011年四川某山羊养殖基地发生该病，确诊为山羊地方性鼻内肿瘤(ENT)，并首次报道了ENT的病原[14]。2013年1月至7月四川省攀枝花市某羊场山羊发生鼻内肿瘤[15]。ENT具有明显的接触传染性，病程长，且发病者多数为成年羊。临床表现为食欲减退，极度消瘦，呼吸困难，鼻漏，出现鼻内单侧或双侧性增生物。本试验调查了陕西省发生ENT患羊的症状，剖检患羊，观察组织病变，对肿瘤进行切片，HE染色观察，初步认定为山羊地方性鼻内肿瘤，并进行ENTV前病毒基因的PCR检测和序列分析，最终确定该病原为山羊地方性鼻内肿瘤病毒。本病例是陕西省首次报道的山羊地方性鼻内肿瘤病例。山羊地方性鼻内肿瘤病由于病程长，容易和其他常见的羊呼吸道疾病混淆，极易在羊群中长期存在，造成大批感染。鉴于我国养羊规模巨大，应制定计划防治该病，特别是在引种时要加强检疫工作，因而应尽快建立多种特异性的临床检测诊断方法，采取积极的净化措施，防止该病在我国造成更严重的危害。

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Diagnosis of Enzootic Nasal Tumor in Goats

WANG Jing,ZHOU Man,HE Ya-peng,FU Ming-zhe,XU Xin-gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi，712100,China)

A comprehensive analysis about epidemiology,clinical symptoms,pathological lesions was made in a goat farm in Shaanxi in order to diagnose the goat with tumors.Then a pair of primers were designed and synthesized according to the enzootic nasal tumor virus of goat(ENTV-2)genome sequence in GenBank.The target fragment was directly amplified by PCR technique and sequenced,which indicated that it was highly related to the ENTV-2.In conclusion,researchers found that the disease was enzootic nasal tumor which was elicited by enzootic nasal tumor virus.

goat; Enzootic nasal tumor virus; pathological lesion; sequence analysis

2016-06-16

西北农林科技大学大学生创新创业训练计划项目(201610712019)；陕西省重点产业创新链项目(2016KTZDNY02-06)；陕西省农业科技创新与攻关项目(2016NY-092)；陕西省重大农技推广服务试点项目(2016畜牧-羊-20)

王 景(1995-)，女，甘肃兰州人，本科，主要从事兽医学研究。△同等贡献作者 *通讯作者

S855.3

B

1007-5038(2017)02-0129-04