宁夏部分地区腹泻羔羊源大肠埃希菌的分离鉴定与药敏试验

谢秀兰，马小明，黎 帅，康晓冬，高海慧，李颖康*

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏大学新华学院，宁夏银川 750021)

宁夏部分地区腹泻羔羊源大肠埃希菌的分离鉴定与药敏试验

谢秀兰1，马小明1，黎 帅2，康晓冬1，高海慧1，李颖康1*

(1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏大学新华学院，宁夏银川 750021)

为掌握宁夏地区羔羊腹泻源大肠埃希菌的耐药性，采集腹泻羔羊肛拭子90份，开展大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验。结果分离到78株大肠埃希菌，对头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类、氟苯尼考、青霉素类、四环素等抗菌药物有较高的敏感性，对万古霉素、复方新诺明、克林霉素耐药(耐药率78.21%～94.87%)。结果表明，宁夏地区羔羊腹泻源大肠埃希菌对抗菌药物保持较高的敏感率，耐药现象并不严重。

羔羊；腹泻；大肠埃希菌；药敏试验

羔羊腹泻是羔羊的一种急性肠道传染病，大肠埃希菌、霉菌、沙门菌、魏氏梭菌、轮状病毒、球虫、隐孢子虫等微生物、寄生虫均可导致羔羊腹泻[1-2]。此病在世界许多国家中流行，是造成羔羊成活率低下的主要原因。致病性大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)是引起羔羊腹泻的最常见的病原因素[3-4]。该病在宁夏地区发病率较高，严重危害该地区养羊业发展，试验针对宁夏地区腹泻羔羊开展大肠埃希菌的分离鉴定和药敏试验，这对防治羔羊腹泻具有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 宁夏地区发生腹泻的羔羊的粪便肛拭子，插入1支C-B运输培养基，12 h 内实验室送检。

1.1.2 试剂与仪器 药敏纸片，杭州天和微生物试剂有限公司产品；2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL 2 000、细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；营养琼脂、SS培养基、伊红美蓝培养基等培养基，青岛海博生物技术有限公司产品；脱纤维绵羊血，北京索莱宝科技有限公司产品；VITEK 2革兰阴性细菌鉴定卡、梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统，法国梅里埃公司产品；电子比浊仪(DensiCHEK Plus)，美国BioMerieux公司产品。

1.2 方法

1.2.1 大肠埃希菌的分离鉴定 无菌操作，将肛拭子分别分区划线接种SS琼脂、伊红美蓝琼脂、绵羊血平板，37 ℃培养18 h～24 h，观察菌落形态特征，挑取典型菌落，接种SS琼脂、伊红美蓝琼脂平板纯培养，并进一步进行细菌鉴定。取纯培养物涂片，革兰染色，观察细菌形态。

1.2.2 VITEK2 Compact的细菌鉴定 在灭菌的4.5 g/L生理盐水中，加入菌液，电子比浊仪调整其浓度为0.5麦氏单位，插入革兰阴性细菌鉴定卡，应用VITEK2 Compact全自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定。

1.2.3 细菌16 S rRNA鉴定 16 S rRNA基因扩增采用细菌通用引物，序列为：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

提取纯化培养物DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O补足25 μL。PCR反应条件：95 ℃4 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将序列进行Blast比对分析，并与GenBank中大肠埃希菌的16 S rRNA基因核苷酸序列进行同源性分析。

1.2.4 肠致病性大肠埃希菌(EPEC)和肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)的PCR检测 按照文献[5]记载的引物，进行肠致病性大肠埃希菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)和肠产毒性大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)的PCR检测。

EPEC检测eae A基因，引物序列为：TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT；GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG；目的片段482 bp；

ETEC检测LT基因，引物序列为：TCTCTATGTGCATACGGAGC；CCATACTGATTGCCGC- AAT；目的片段322 bp；

EPEC和ETEC的PCR反应体系相同，25 μL反应体系，Master PCR mix 12.5 μL,上游引物 1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL；EPEC的反应条件为：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，30 cycles；72℃ 10 min；ETEC的反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，30 cycles；72℃ 10 min。反应结束后，15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 药敏试验 用K-B纸片扩散法进行药敏试验，吸取30 μL菌液，置于普通琼脂培养基中央，用涂布棒将菌液均匀涂于培养基表面，至菌液被完全吸收后，将不同的药敏片贴在培养基的适当位置，置于37℃培养箱中18 h ～24 h，观察抑菌情况，判定依照NCCLS标准。

2 结果

2.1 病原的分离、培养与镜检

分离得到的78株细菌，其中表现β型溶血的有9株，不溶血的有69株，细菌在SS平板上形成红色菌落(图1A)；部分分离菌在绵羊血平板上形成β溶血环(图1B)，传代后溶血环会消失；EMB平板上形成具有金属光泽菌落(图1C)；分离菌经革兰染色后镜检，可见革兰阴性的红色小杆菌(图1D)。

A.SS平板上生长现象; B.血平板上生长现象; C.EMB上生长现象; D.革兰染色后镜检(100×)

2.2 VITEK2 Compact的细菌鉴定

分离菌的纯培养物经VITEK2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定，为大肠埃希菌。

2.3 PCR扩增结果

以提取的分离菌基因为模板，用合成的通用引物扩增分离菌16 S rRNA基因，扩增出大小约为1 504 bp目的片段，与预期大小相符(图2)。PCR产物的测序结果经比对，同源性最高的序列均为大肠埃希菌各株系的1 6S rRNA，同源性为100%。

2.4 EPEC、ETEC检测结果

以提取的分离菌基因为模板，分别用ETEC、EPEC引物进行PCR扩增，扩增出大小分别为322 bp和482 bp的片段，与预期大小相符(图3A和B)。EPEC检测出66株，占84.62%；ETEC没有检测到。

2.5 药敏试验

78株大肠埃希菌的药敏试验结果见表1。从结果可以看出，大肠埃希菌具有多重耐药性，对克林霉素、万古霉素、复方新诺明的耐药率最高，分别为94.87%、84.62%和78.21%。对头孢类抗生素具有较高的敏感性，头孢曲松、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢氨苄、头孢拉定的敏感率分别为89.74%、89.74%、87.18%、83.33%和82.05%。氨基糖苷类抗生素，阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素的敏感率分别为88.46%、78.21%和75.64%。青霉素类抗生素，哌拉西林、氨苄西林、阿莫西林的敏感率分别为74.36%、70.51%和66.37%；喹诺酮类抗菌药物，氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星的敏感率分别为82.05%、74.36%和71.79%；氟苯尼考的敏感率为76.92%，四环素的敏感率为62.82%。红霉素和恩诺沙星为中度敏感。耐药的抗菌药物占13.63%(3/22)，敏感的抗菌药物占77.27%(17/22)。

M.DNA标准DL 2 000；1～6.分离菌的16 S rRNA PCR产物；7.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000；1-6.16 S rRNA PCR products of isolates；7.Negative control

M1.DNA Marker DL 2 000；1.阳性对照；2～21.部分临床样品；22.阴性对照；M2.DNA标准DL 2 000

药物名称Drugs敏感/株Sensitivity中介/株Moderateresistance耐药/株Resistance耐药率/%Drugresistancerate敏感率/%Drugsensitiverate阿米卡星Amikacin69456．4188．46哌拉西林Piperacillin5831721．7974．36庆大霉素Gentamicin6151215．3878．21红霉素Erythromycin1502734．621．28头孢曲松Ceftriaxone70267．6989．74氨苄西林Ampicillin5522126．9270．51恩诺沙星Enrofloxacin9511823．0811．54阿莫西林Amoxicillin5262025．6466．67氧氟沙星Ofloxacin645911．5482．05氟苯尼考Florfenicol6041417．9576．92诺氟沙星Norfloxacin5931620．5174．36头孢拉定Cefradine6431114．1082．05头孢唑林Cefazolin70178．9789．74头孢噻肟Cefotaxime682810．2687．18万古霉素Vancomycin846684．6210．26头孢氨苄Cefalexin6531012．8283．33链霉素Streptomycin5712911．5473．08四环素Tetracycline4912835．9062．82环丙沙星Ciprofloxacin5651721．7971．79卡那霉素Kanamycin5911810．2675．64复方新诺明Co⁃trimoxazole2156178．212．56克林霉素Clindamycin137494．871．28

3 讨论

大肠埃希菌本身极易产生耐药性，加之抗菌药物的滥用致使饲养环境中耐药菌株越来越多。国内不少学者开展了羔羊腹泻源大肠埃希菌的耐药试验，张希利等[1]对新疆阿勒泰地区羔羊腹泻病的研究结果表明，分离的大肠埃希菌对左氟沙星、新霉素、头孢噻呋、甲硝唑敏感，对卡拉霉素、庆大霉素、阿莫西林、土霉素、磺胺嘧啶具有耐药性；杨耀等[2]研究甘南州藏羔羊腹泻大肠埃希菌K99株对硫酸黏菌素、恩诺沙星、氯霉素极敏；对头孢三嗪、氟哌酸、丁胺卡那霉素高敏；对庆大霉素、妥布霉素中敏；对青霉素、链霉素、复合磺胺等不敏感；夏利宁等[4]从新疆规模化养羊场粪便中分离出638株大肠埃希菌，对安普霉素和阿莫西林/克拉维酸钾耐药率高达33.9%和21.2%；对氟苯尼考最敏感，耐药率仅为3.1%；其余的药物耐药率在7.5%～15.6%。东主措[6]研究发现青海省海南州的1例羔羊大肠埃希菌对链霉素、氯霉素耐药性最高，头孢哌酮、阿米卡星、头孢噻肟为敏感药物。本试验中，78株羔羊腹泻源大肠埃希菌对常用22种抗生素表现不同，对克林霉素、万古霉素、复方新诺明的耐药率最高；敏感率较高的抗菌药物共计17种，依次为头孢类、氨基糖苷类、青霉素类、喹诺酮类、氟苯尼考和四环素，敏感抗菌药物数量占77.27%，表明宁夏地区羔羊腹泻源大肠埃希菌对抗菌药物保持较高的敏感率，耐药现象不严重。

致病性大肠埃希菌和非致病性大肠埃希菌在培养特性和生化反应等方面相似，但致病性大肠埃希菌具有特殊的血清型、肠毒素或毒力因子。EPEC引起的病变是黏附与脱落，由eae基因编码的紧密素外膜蛋白是引起。ETEC的2个主要毒力因子是黏附素和肠毒素，肠毒素依据其生物学特性被分为不耐热肠毒素和耐热性肠毒素[7]。本试验通过PCR方法测定分离菌株的毒力因子和肠毒素基因片段，78株大肠埃希菌分离株中检测到了66株EPEC，数量最多，没有检测到ETEC,表明宁夏地区羔羊腹泻源大肠埃希菌主要类型为EPEC。

[1] 张希利，赵万军，晁旭东，等.致羔羊腹泻大肠杆菌的分离鉴定[J].新疆农垦科技，2016，39(2)：35-36.

[2] 杨 耀，李小玲.甘南州藏羔羊腹泻病病原调查[J]畜牧与兽医，2015，47(1)：90-93.

[3] 谭诗文，肖耀南，艾玉萍，等.贵州羔羊致病性大肠埃希菌血清型和致病因子的研究——大肠埃希菌的分离、血清型、致病因子和致病性试验[J].贵州农业科学，2000，28(2)：9-14.

[4] 夏利宁，向 发，罗小鱼，等.新疆某羊场分离的大肠杆菌对抗生素耐药性调查[J].新疆农业科学，2014，51(1)：156-162.

[5] Brandal L T，Lindstedt B A，Aas L，et al.Octaplex PCR and fluorescence-based capillary electrophoresis for identification of human diarrheagenicEscherichiacoliandShigellaspp[J].J Microbiol Methods，2007，68(2)：331-341.

[6] 东主措.一例羔羊大肠杆菌病的诊断与药敏试验[J].中兽医学杂志，2015(8)：4.

[7] 妥 鑫，刘永明，黄美州，等.羔羊腹泻细菌和病毒病原的研究进展[J].中国畜牧兽医，2016，43(3)：831-836.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofE.colifrom Lambs with Diarrhea in Ningxia Region

XIE Xiu-lan1，MA Xiao-ming1，LI Shuai2，KANG Xiao-dong1，GAO Hai-hui1，LI Ying-kang1

(1.InstituteofAnimalScience，NingxiaAcademyofAgricultureandForestrySciences,Yinchuan,Ningxia,750002，China；2.XinhuaCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia，750021，China)

In order to understand the drug resistance of the lamb diarrheaE.coliin Ningxia region,90 anal swab samples were collected to isolate and identifyE.coli,and test the drug sensitivity.Results showed that 78 strains ofE.coliwere isolated.Isolates ofE.coliwere sensitive to cephalosporin antibiotics,aminoglycoside antibiotics,quinolones,fluorine benzene nicol,penicillin class,tetracycline,and resistant to vancomycin，compound trimolazole and clindamycin.The results suggested thatE.coliisolated from lambs with diarrhea in Ningxia region kept high sensitivity rate to antimicrobials.

lamb; diarrhea;Escherichiacoli; drug sensitivity test

2016-04-28

宁夏农林科学院先导基金项目(NKYJ-14-10)

谢秀兰(1980-)，女(回族)，宁夏平罗人，副研究员，硕士，主要从事动物病原分子生物学研究。*通讯作者

S852.612;S858.26

B

1007-5038(2017)02-0116-04