长期不同施肥设施菜地土壤酶活性与微生物碳源利用特征比较

李 猛，张恩平，张淑红，周 芳，王 月，谭福雷，韩丹丹

（沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110866）

长期不同施肥设施菜地土壤酶活性与微生物碳源利用特征比较

李 猛，张恩平*，张淑红，周 芳，王 月，谭福雷，韩丹丹

（沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110866）

【目的】探讨长期不同施肥条件下设施菜地土壤的酶活性与微生物碳源利用特征，旨在为推进耕地建设与健康质量保护提供理论依据和数据支持。【方法】供试土壤采自沈阳农业大学番茄 28 年定位施肥设施菜地，选取其中 6 个处理：N0、N1、N2、MN0、MN1、MN2进行分析，其中 M 表示施腐熟马粪 75000 kg/hm2，N0为不施肥，N1、N2尿素施用量为 652、1304 kg/hm2。采用 Biolog-ECO 法解析了土壤酶活性与微生物碳源利用特征的变化。【结果】施用有机肥可以显著提高土壤有机质、速效磷、速效钾等养分含量，长期单施氮肥可增加土壤铵态氮和硝态氮含量，但有机质、速效磷和速效钾含量较对照下降。增施有机肥可以不同程度地提高土壤酶活性，而单施氮肥导致酶活性降低。增施有机肥可有效提高土壤微生物对碳源的利用能力，提高微生物群落功能多样性，单施氮肥作用相反。具体表现为：菜田微生物对六类碳源利用能力由高到低依次为氨基酸类、糖类、羧酸类、聚合物类、胺类、酚酸类；其中对 L-丝氨酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、L-精氨酸、丙酮酸甲脂、吐温 80、D-纤维二糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露醇利用率较高，而对α-环式糊精、2-羟苯甲酸、γ-羟基丁酸基本不利用；31 种碳源对 PC1 和 PC2 贡献较大的分别有 12 种和 6 种 (|r| ＞ 0.5)。综合比较，以有机肥配施一倍量氮肥 (MN1) 处理效果最佳，长期施用可以为设施菜地微生物创造最适宜的生存环境，使其保持较高的群落功能多样性。【结论】长期不同施肥使得土壤微生物群落形成了不同的碳代谢方式，这是土壤微生物适应环境变化的结果，也是土壤生态系统中“植物–土壤–微生物”互作的结果。

长期施肥；设施菜地；土壤酶活性；土壤微生物；碳代谢

土壤酶活性与土壤营养物质的转化密切相关，调查土壤酶活性强弱，有助于评判土壤的供肥能力[1]。土壤微生物是土壤生化过程的驱动力，是物质循环和能量流动的主体[2]。施肥是影响土壤质量演化及其可持续利用最为深刻的农业措施之一[3]。施肥对林地和大田土壤酶活性和微生物群体的影响研究较多[4–7]，对设施土壤的研究主要集中在微生物类群[8–9]和主要功能菌群[10–11]，对施肥条件下设施菜田微生物碳源利用特征的报道较少。本研究以沈阳农业大学连续 28 年长期定位施肥的设施菜田土壤为研究对象，分析了菜田土壤微生物碳源利用特征，并结合土壤酶活性揭示土壤微生物群落对肥料施用的响应规律，旨在为保持设施菜田土壤健康和积极推进耕地质量的保护与建设提供理论依据和数据支持。在土壤中广泛存在且对土壤肥力培育起重要作用的是氧化还原酶类和水解酶类[12]，本研究中共选择测定了2 种氧化还原酶 (过氧化氢酶、多酚氧化酶) 和 4 种水解酶 (转化酶、荧光素二乙酸酯酶、脲酶、中性磷酸酶)。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试土壤取自沈阳农业大学番茄长期定位施肥试验菜田，试验地位于辽宁省沈阳市沈河区 (北纬41°31′、东经 123°24′)，属北温带半湿润大陆性气候，降水集中在夏季，全年降水量 600～800 mm，夏季时间较短，冬寒时间较长，近 6 个月，年平均气温 6.2～9.7℃，年日照时间为 2517 h，全年无霜期为 150 d 左右。土壤类型为草甸土，试验始于 1988年，此时耕层养分含量为：有机质 24.30 g/kg，全氮1.164 g/kg，碱解氮 86.41 mg/kg，速效磷 70.80 mg/kg，速效钾 56.14 mg/kg，交换性盐基总量 14.56 cmol/kg，pH 值 6.75。至 1996 年秋季之前一直为露地栽培试验，从 1997 年春至今为设施栽培试验。设施栽培前2 年为茄子，后一直为番茄，品种为‘辽园多丽’。

本研究选取其中的 6 个处理进行试验，分别为：N0、N1、N2、MN0、MN1、MN2。M 表示施有机肥 (腐熟马粪) 75000 kg/hm2，N0表示不施氮肥，N1、N2表示尿素施用量为 652、1304 kg/hm2。每处理 3次重复，采用完全随机区组设计。有机肥于定植前一次性施入，氮肥在生长季节内分 2 次追施，为防止肥料相互渗透影响，将每个小区建成 0.8 m 深的无底水泥池，面积为 1.5 m2(1 m × 1.5 m)。

试验从 2015 年 1 月 15 日持续到 2016 年 1 月 10日，春茬于 2015 年 3 月 18 日定植，8 月 3 日拉秧，调查了土壤理化性质和酶活性；秋冬茬于 2015 年 8月 28 日定植，2016 年 1 月 10 日拉秧，研究了土壤微生物的碳源利用状况。

1.2 土壤理化性质的测定

采用 5 点取样法采集 0—20 cm 土壤，清除表层杂草及凋落物，混合制样，置于室内自然风干后过筛保存。参照鲍士旦[13]的方法测定：有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；铵态氮含量采用 2 mol/LKCl 浸提靛酚蓝比色法测定；硝态氮含量采用酚二磺酸比色法测定；速效磷含量的测定采用 0.5 mol/L NaHCO3浸提—钼锑抗比色法；速效钾含量的测定采用 NH4OAc 浸提—火焰光度计法；土壤含水量采用烘干法测定。

1.3 土壤酶活性测定

取样方法同 1.2。参照严昶生[12]和李振高等[14]的方法测定：过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定；多酚氧化酶活性采用没食子素比色法测定；转化酶活性采用硫代硫酸钠滴定法测定；脲酶活性采用苯酚钠–次氯酸钠比色法测定；磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定；FDA 水解酶活性采用荧光素比色法测定。

1.4 土壤微生物群落碳代谢的测定与分析

参照李振高等[14]的方法进行培养。称取相当于 5 g 烘干土重的新鲜土样，加入盛有 45 mL 已灭菌的0.85% 生理盐水锥形瓶中，密封振荡 0.5 h 后，依次稀释为 10–2、10–3的梯度液。将 ECO 微平板从冰箱中取出，预热到 25℃，将 10–3稀释液接种到平板中，接种量为每孔 150 μL。将接种好的 ECO 平板加盖，在 37℃ 恒温培养箱中连续培养 168 h，每隔 24 h用 ELISA 自动读数装置进行读数。

土壤微生物群落整体碳代谢能力用 Biolog-ECO微平板的每孔平均吸光值 (average well color development，AWCD) 表示:

AWCD=∑ (C−R)/n

式中，C 为反应孔的吸光度，R 为对照孔的吸光度，n 为碳源的种类 (n = 31)。

以拐点 (120 h) 处的 AWCD 值计算不同施肥处理的香农指数 (H)，丰富度指数 (S)，优势度指数 (D)来表征土壤微生物群落功能多样性。

式中，Pi为第 i 孔相对吸光度值 (C-R) 与整个平板相对吸光度值总和的比率。

表1 各施肥处理下土壤理化状况Table 1 Soil physical and chemical characters under different fertilization treatments

S 为颜色变化的孔数，以吸光值 (C−R) ≥ 0.2 的个数计。

基于拐点 (120 h) 处土壤微生物对 31 种单一碳源 (共六类：糖类 10 种，羧酸类 7 种，氨基酸类 6种，聚合物类 4 种，胺类 2 种和酚酸类 2 种) 的利用情况进行碳代谢的指纹图谱分析、主成分分析和聚类分析。指纹图谱分析有助于全面了解微生物群落碳代谢特征，主成分分析可以明确土壤微生物利用的主要碳源，聚类分析可以清楚直观地反映各处理间关系的远近。

1.5 数据分析方法

采用 Excel 软件对数据进行初级统计分析，采用SPSS 18. 0 软件对数据进行单因素方差分析 ( Oneway ANOVA)、显著性检验。

2 结果与分析

2.1 长期施肥对土壤理化性质的影响

经过 28 年的连续施肥，各处理理化性质如表 1所示。可以看出，施肥能够改变土壤理化性质，施用有机肥可以显著提高土壤有机质、速效磷、速效钾等养分含量，并高于原始值；长期单施氮肥致使三者含量降低，且低于原始水平。土壤铵态氮和硝态氮含量主要受施氮水平影响，施氮量达到 N2水平时，土壤铵态氮和硝态氮含量均显著高于同等条件下的 N1和 N0处理。单施有机肥 (M) 较 N2处理可显著提高土壤水分含量，与其他处理差异不显著。

2.2 长期施肥对土壤酶活性的影响

不同施肥处理对 6 种酶活性产生的影响不同(表 2)。单施有机肥或与氮肥配施处理的过氧化氢酶、转化酶、荧光素二乙酸酯酶和脲酶活性显著高于单施氮肥处理，4 种酶活性从施有机肥到单施氮肥呈下降趋势，而氮肥与有机肥配施时，施氮量对 4种酶活性无显著影响，而当氮肥单施时，过氧化氢酶和脲酶活性随施氮量增加而显著下降。多酚氧化酶活性的变化趋势不明显，仅在配施有机肥时，随氮肥投入量的增加逐渐升高；除 MN1和 N1差异不显著外，各处理之间中性磷酸酶活性均达显著差异，表明中性磷酸酶活性对施肥比较敏感，不同施肥对其影响显著。

2.3 土壤微生物群落碳代谢整体能力分析

分析每孔平均吸光值 (average well color development，AWCD) 变化趋势可以区分样品间微生物群落碳代谢能力的差异 。从图 1 可以看出，随着培养时间的延续，不同处理微生物的碳源利用程度均逐渐增强。在 0～24 h 内，各处理 AWCD ＜ 0.1，表明碳源基本未被利用；在 24～96 h 内，各处理AWCD 快速增加，表明微生物碳源利用增加；96 h之后，AWCD 增长速率减缓，至 120 h 趋于稳定，此时碳源利用趋于最大。特别的是，N0、N1最先达到稳定期，而 N2的增长速率最低。在整个培养过程中，各施肥处理土壤微生物群落的 AWCD 值存在明显差异。以拐点处 120 h 为例，MN1＞ MN0＞ MN2≥N0≥ N1＞ N2，即配施有机肥处理高于单施氮肥处理，其中以 MN1最为显著。单施氮肥将会导致微生物活性的降低，以 N2最为显著，比 N0降低了 49%。

表2 不同施肥处理土壤酶活性Table 2 Enzyme activities affected by fertilization treatments

图1 不同处理平均每孔颜色变化率Fig.1 Average well color development of soil microbial community in different treatments

2.4 土壤微生物碳代谢指纹图谱分析

Biolog 代谢指纹图谱是指土壤微生物对微平板上 31 种碳源的利用能力，通过图谱分析可以全面了解设施菜地微生物碳源利用特征 (图 2、图 3)。有机肥配施氮肥处理土壤微生物对六类碳源的总利用高于单施氮肥处理，以 MN1优势最明显；在六类碳源中，氨基酸类碳源利用率最高，酚酸类碳源最低，依次为：氨基酸类 ＞ 糖类 ＞ 羧酸类 ＞ 聚合物类 ＞ 胺类 ＞ 酚酸类。具体地，以 AWCDi≥ 0.8 碳源计：MN0有 13 种 (糖类 4 种，氨基酸类 3 种，羧酸类 3种，聚合物类、酚酸类和胺类各 1 种)，MN1同为 13种 (糖类 3 种、氨基酸类 4 种、羧酸类 3 种、聚合物类 2 种、酚酸类 1 种)，均占总碳源的 41.9%；MN2有 10 种 (糖类 4 种、氨基酸类 3 种、羧酸类 2 种、聚合物类 1 种)，占总碳源的 32.3%；N0有 4 种 (氨基酸类 2 种、羧酸类 1 种、聚合物类 1 种)，占总碳源的 12.9%；N1有 5 种 (糖类 2 种、氨基酸类 2 种、羧酸类 1 种)，占总碳源的 16.1%；N2有 3 种 (糖类 2种、羧酸类 1 种)，占总碳源的 9.7%，表明长期施肥改变了设施菜地微生物对碳源的利用能力，增施有机肥可显著提高土壤微生物对碳源的利用率，少量氮肥单施可使微生物碳源利用略有增加，而过量氮肥投入将会导致微生物碳源利用能力下降。进一步分析可知，在 31 种碳源中，设施菜田土壤微生物对L-丝氨酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、L-精氨酸、丙酮酸甲脂、吐温 80、D-纤维二糖、D-半乳糖醛酸和 D-甘露醇利用率较高，而对 α-环式糊精、2-羟苯甲酸、γ-羟基丁酸基本不利用。

图2 长期施肥土壤微生物碳代谢指纹图谱 (120 h)Fig.2 The fingerprint of soil microbial biomass carbon metabolism in different treatments

图3 长期施肥条件下土壤微生物对六类碳源的总体利用状况 (120 h)Fig.3 The overall utilization of six kinds of carbon sources in different treatments

图4 长期施肥土壤微生物碳代谢主成分分析和聚类分析Fig.4 The principal component analysis and cluster analysis of soil microbial biomass carbon metabolism in the long term fertilization

2.5 土壤微生物碳代谢主成分分析与聚类分析

利用培养 120 h 的 AWCD 值，对长期施肥设施菜田土壤微生物利用单一碳源的特性进行主成分分析和聚类分析 (图 4)。由图 4a 可知，碎石图曲线从第 10 个因子开始变得比较平缓 (特征根 ≤ 1)，应用主成分分析，在 31 个因子中共提取 10 个主成分，累积方差贡献率达到 90.24%。其中第一主成分(PC1) 的特征根为 7.204，方差贡献率为 23.238%，第二主成分 (PC2) 特征根为 4.42，方差贡献率为14.257%；第三主成分 (PC3) 特征根为 3.753，方差贡献率为 12.106%。其余 4～10 主成分的贡献率均小于 10%。选取 PC1 和 PC2 分析不同施肥处理微生物碳源利用情况 (图 4b)，不同施肥处理的碳源利用在PC 轴上差异显著。MN1、MN2位于 PC1 的正端；N0、N1、N2位于 PC1 的负端；MN0位于 PC1 的中段。在PC2 上，各处理基本分布在中段位置，仅 MN2明显的分布在负端。进一步分析 31 种碳源在 PC1、PC2上的载荷值 (表 3)，载荷值越高表示对应碳源对主成分的影响越显著。从表 3 可知，以|r| ＞ 0.5 计，对PC1 贡献较大的碳源有 12 种，主要包括糖类 3 种、氨基酸类 4 种、羧酸类 1 种、聚合物类 2 种、酚酸类和胺类各 1 种；对 PC2 贡献较大的有 6 种，主要包括糖类 2 种，氨基酸类、羧酸类、聚合物类、酚酸类各 1 种。

聚类分析可以探究各施肥处理间碳代谢的远近关系，以组间平均联接的树状图来表示 (图 4c)。从该图中可以发现，不同施肥处理的碳源利用方式可以聚为 2 类、3 类或 4 类。在 3 种分类方法中，MN1均单独聚为一类，表明 MN1施肥处理下菜地微生物已经形成了独特的碳源代谢方式。以聚为 3 类为例，除 MN1外，N2也单独聚为一类，N0、N1、MN0、MN2等处理的土壤微生物碳源代谢方式相似，表明长期施肥改变了微生物的碳代谢方式。

表3 不同碳源在 PC1 和 PC2 上的载荷值 (|r| ＜ 0.4 的数值未显示)Table 3 Correlation analysis of different carbon source utilization with PC1 and PC2 (the values of |r| ＜ 0.4 are not shown)

综合上述分析，在 PC1 上，有机肥配施氮肥处理土壤微生物对ß-甲基 D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、I-赤藻糖醇、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、α-丁酮酸、吐温 80、苯乙基胺、4-羟基苯甲酸、α-环式糊精等 12 种碳源的利用高于单施氮肥的处理；在 PC2 上，MN1处理微生物对吐温80、D-木糖、α-D-乳糖、2-羟苯甲酸的利用略高于其它处理，N2处理微生物对 L-精氨酸，D-苹果酸的利用高于其它处理，而其它 4 个处理对上述 6 种碳源的利用情况较为接近。

2.6 土壤微生物群落功能多样性

通过 AWCD 值 (120 h) 计算得到微生物功能多样性指数 (表 4)，发现增施有机肥处理微生物的香农指数和丰富度指数均高于不施肥和单施氮肥处理，但是其常见种的优势度指数降低，以 MN1最明显，表明有机肥配施一倍量氮肥可以提升土壤微生物种类和丰度，弱化某些单一菌群的优势度；单施氮肥处理的优势度最高，但是其香农指数和丰富度指数最低，表明长期单施氮肥将会导致土壤中微生物的种类和数量减少，促使某些适应环境的菌群发挥出特定的优势，但是其微生物整体代谢功能依然明显下降。

表4 施肥处理下微生物多样性指数Table 4 Diversity indexes of soil bacteria in different treatments at 120 h

3 讨论与结论

土壤酶学一开始便与土壤肥力的研究紧密结合在一起，土壤酶活性的高低能够反映土壤养分转化的强弱[12]。研究已经证明，土壤酶活性作为土壤肥力的评价指标是完全可行的，但多数学者认为，单一的酶活性并不能反映出土壤肥力的实际水平，应该综合考虑那些与土壤肥力直接相关的、分布最广泛的土壤酶活性[15–17]。本文共研究了长期施肥条件下 6种土壤酶活性，结果表明，有机无机肥配施可不同程度地提高多种土壤酶活性，而单施化肥将会导致酶活性的显著降低，这同高瑞等[18]在黄土和张恩平等[19]在设施菜田中的研究结论一致。施肥对土壤酶活性与土壤理化性质的影响基本相似，这可能是土壤酶与土壤理化性质关系密切[20–22]的缘故，因此在实际生产中可通过增施有机肥或有机无机肥配施来改善土壤理化性质，提高土壤酶活性，提升土地利用效率，同时减少化肥的施用量。

在土壤微生物方面，有机肥与无机肥配施可以增加土壤微生物数量，增强微生物的活性[6,23]，提高微生物群落功能多样性[24–25]，在本研究中以 MN1的效果最佳。综合分析可知，这是有机肥配施氮肥提高了土壤微生物对碳源的利用率，增强了土壤微生物整体碳代谢能力 (AWCD)，同时改变了土壤微生物对碳源的利用方式和利用能力的缘故，主成分分析表明，施肥对微生物群落碳代谢影响显著，对PC1 贡献较大的碳源，主要是氨基酸类，对 PC2 主要是糖类。在本研究中，土壤微生物对氨基酸类碳源的利用率最高，前人的研究结果[8]表明，长期偏施氮肥使得土壤中好气性固氮菌、亚硝化细菌、反硝化细菌、氨化细菌等氮素功能菌群数量增加。同时，有研究报道[26–27]，化肥或秸秆施入将限制土壤中某些细菌的生长，减少土壤细菌种类，改变土壤中的优势菌群，使微生物对碳源的利用多样性降低，本研究微生物群落功能多样性指数证明了该论断。施肥可以改变土壤微生物群落结构和功能多样性[28]，因此可推测本研究条件下长期偏施氮肥，使得土壤中氮素积累，氮素转化功能菌成为该施肥条件下的优势菌群，数量较高且比较活跃。结合聚类分析，MN1处理土壤微生物已经形成了独特且最有益的碳源利用方式，偏好碳源为氨基酸类和糖类，长期施用可以为设施菜地微生物创造最佳的生存环境，从而使其保持较高的群落功能多样性；而长期单施氮肥的土壤微生物碳源利用相似，偏好糖类，常见种优势度有所增加，但整体群落功能多样性显著降低。此种现象，可能与植物根系分泌物有关。研究表明，不同的氮素形态会对番茄根系分泌物各组分含量产生影响，以铵态氮为氮源时番茄根系分泌的铵态氮、游离氨基酸、可溶性糖较多[29]，表明施肥类型能够影响番茄根系物质分泌，而分泌物中包含的

糖类、氨基酸、羧酸类在为土壤微生物提供碳源的同时，其他次生代谢物质将对根际微生物群落结构产生选择塑造作用[30]，此后再通过根际微生物介导影响土壤酶活性[31]，最终推动相关的微生物群落逐渐成为优势菌群，而这种变化正是土壤微生物通过自身调节适应土壤生态环境变化的结果，也是土壤生态系统中“植物–土壤–微生物”互作的结果。

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Comparison of soil enzyme activities and microbial C metabolism in installed vegetable fields under long-term different fertilization

LI Meng, ZHANG En-ping*, ZHANG Shu-hong, ZHOU Fang, WANG Yue, TAN Fu-lei, HAN Dan-dan
( College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China )

【Objectives】Soil microbial carbon source utilization characteristics under a long-term fertilization in vegetable fields were discussed to reveal the response mechanism of soil microbial community for fertilizing and provide a theoretical basis and data support in maintaining facilities vegetable soil health and actively promoting quality of cultivated land protection and construction.【Methods】The investigation used soil from a 28 years fertilization protected vegetable field experiment in Shenyang Agricultural University, and 6 treatments were chosen, including no fertilization control (N0), organic fertilizer only (MN0) and nitrogen fertilizer plus organic fertilizer (MN1, MN2), nitrogen fertilizer only (N1, N2). Organic manure was horse manure (75000 kg/hm2), N1and N2treatments were urea of 652 kg/hm2、1304 kg/hm2. Biolog ECO-plate methods were used to analyze the soil microbial carbon source utilization characteristics.【Results】Application of organic fertilizer could significantly improve the contents of soil organic matter, available phosphorus and available potassium. Single nitrogen fertilization decreased these contents, but increased ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in soil. The enzymeactivities could be improved by applying organic manure, while the activities under the single application of nitrogen fertilizer were decreased. In terms of carbon source utilization, the application of organic fertilizer could use more soil microbial carbon source than that in single N fertilization. The prior used 6 kinds carbon sources were amino acids, carbohydrates, carboxylic acids, polymers, amines and phenolic acids in turn. The fingerprint analysis showed that soil microorganism in the facility vegetable field could use the following carbon source effectively: L-serine, N-acetyl glucosamine, L-asparagine acid, L-arginine, methyl pyruvate, Tween 80, D-cellobiose, D-galacturonic acid and D-mannitol. In contrast, α-ring cyclodextrins, 2-hydroxy benzoic acid and γhydroxybutyric acid were seldom used. About 12 kinds of carbon source had larger contribution to PC1, and 6 kinds to PC2 (|r| ＞ 0.5).【Conclusion】Comprehensive comparison, the most feasible treatment is the organic fertilizer plus 652 kg/hm2of urea in creating the most suitable living environment for soil microorganisms and maintaining a higher functional diversity of microbial community under the long-term application. Single use of organic manure or over use of nitrogen will offset this effect.

long-term fertilization; protected vegetable field; soil enzyme activity; soil microorganism; carbon metabolism

2016–01–28接受日期：2016–05–26

科技部项目（2013BAD20B08）；辽宁省自然科学基金（2015020767）资助。

李猛（1991—），男，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事蔬菜栽培与生态方面的研究。E-mail：806841254@qq.com

* 通信作者 E-mail：zhangep024@163.com