稀土上转换纳米荧光探针的制备与应用

钟 诚

(达州职业技术学院，四川达州，635001)

专题与评述

稀土上转换纳米荧光探针的制备与应用

钟 诚

(达州职业技术学院，四川达州，635001)

阐明了上转换发光机制，综述了上转换纳米荧光探针的制备技术及表面修饰方法，分析了上转换纳米荧光探针的生物医学应用，并展望了其未来的研究方向。

上转换纳米粒子 荧光探针 生物医学应用 制备技术 表面修饰

生物探针是一类用于标记生物大分子(如蛋白质、核酸等)的示踪物质，与生物大分子以化学键或吸附的方式结合，通过放射显影、荧光、化学发光等方式来判断被标记物的有无或位置。传统的生物探针包括放射性同位素、酶、化学发光标记物。

近年来，荧光探针(fluorescent probe)获得了极大的发展与应用，它是一类受激荧光物质，可广泛应用于细胞检测、组织及活体成像、药物分析、疾病早期诊断等，在生物医学领域发挥着重要的作用[1]。荧光探针包括染料、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子等。有机染料和荧光蛋白存在光学稳定性差、斯托克斯位移小、发射峰宽等缺点, 故在生物成像方面的应用受到一定限制[2]。半导体量子点含有Cd、Pb、As等有毒离子，对生物体有潜在的危害。无论是有机染料、荧光蛋白还是量子点，均存在一个难以克服的缺陷，即它们的激发光都处在紫外波段，生物体系中的核酸、多肽、氨基酸、蛋白质、生物体组织等在紫外光的激发下会产生强烈的背景荧光，从而降低检测灵敏度[3]。

通过非线性多光子加和机制吸收长波辐射(如近红外光)而发射短波长荧光(如紫外-可见光)，这种反斯托克斯(anti-Stokes)的发光现象称为上转换荧光[4]。与传统的下转换荧光标记材料相比，上转换纳米荧光探针具有以下优点：(1)发射带窄、反斯托克斯位移大；(2)化学稳定性好、材料毒性低；(3)发光稳定，无闪烁，不易光解和光漂白；(4)可避免生物样品自发荧光的干扰和散射光干扰；(5)激发光位于低能近红外区，对生物组织无损伤，具有高穿透力及空间分辨率，适合体外或活体成像。

1 上转换机制

上转换机制一般归为激发态吸收、能量传递和光子雪崩三种类型。

1.1 激发态吸收

激发态吸收(ESA)的机理是同一个离子从基态能级通过连续(多步)的光子吸收到达激发态能级的过程[5]，如图1(a)所示。电子从E0跃迁到E1能级，是基态吸收(GSA)，电子从E1跃迁到E2能级是激发态吸收(ESA)。当然，若更高能级间的能量差匹配光子能量，还可以引发三光子、四光子吸收。当离子从高能级跃迁回基态能级时，可释放高能光子而发光。

1.2 能量传递

能量传递机制按照能量传递方式的不同包含伴随能量传递的激发态吸收、连续能量传递、交叉弛豫、协同敏化、协同发光。

1.2.1 伴随能量传递的激发态吸收

这种上转换机制的特点是处于激发态的敏化剂离子将能量传递给激活剂离子，使激活剂离子跃迁到激发态，而敏化剂离子无辐射返回基态能级，激活剂再通过ESA，跃迁到更高的能级，如图1(b)所示。

图1 上转换机制示意图

1.2.2 连续能量传递

这种上转换的原理是激活剂连续吸收敏化剂传递的能量，从而跃迁到高能级上，如图1(c)所示。

1.2.3 交叉弛豫

交叉弛豫(cross relaxation)是指同种离子或不同种离子之间的共振能量传递，一种离子从高能级无辐射跃迁至低能级，将能量传递给另一种离子，使其从低能级跃迁至高能级，发生交叉弛豫的离子是指激活剂离子而非敏化剂离子，如图1(d)所示。

1.2.4 协同敏化

两个或多个敏化剂离子同时将能量传递给激活剂离子，使其从基态跃迁到激发态，这种敏化也叫合作上转换，如图1(e)所示。

1.2.5 协同发光

两个相互作用的激发态离子同时返回基态，发射一个能量等于这两个离子跃迁释放能量之和的光子，这种现象称为协同发光，此过程不存在真实的发光能级，如图1(f)所示。

1.3 光子雪崩

光子雪崩过程结合了激发态吸收与能量传递，只不过能量传递发生在同种离子间。光子雪崩的机制，有三能级[6]与四能级[7]系统两种不同的理论。以三能级模型为例，在E0、E1、E2三能级中，激发光能Φ对应于E1→E2的共振吸收，虽然激发光能同基态吸收不共振，但总会有少量粒子被激发到E1与E2之间，然后弛豫到E1能级上。处于E1能级的一个粒子共振吸收Φ光能，从E1跃迁到E2能级，然后与另一个基态粒子发生交叉弛豫，同时跃迁到E1能级，产生两个E1能级的粒子，这两个粒子再分别共振吸收Φ光能，与另两个基态粒子交叉弛豫，变成四个E1能级粒子，如此循环，将使E1能级粒子像雪崩一样急剧增加，而基态粒子急剧减少，导致粒子数反转，被激发到E2能级的粒子向基态跃迁而发射光子。光子雪崩机理如图1(g)所示。

2 上转换纳米探针的制备与修饰

目前，研究最多的上转换纳米荧光探针是以NaYF4为基质，掺入Yb3+作敏化剂，掺入Er3+、Tm3+、Ho3+、Pr3+等作激活剂。理想的上转换荧光探针须满足小尺寸(小于30 nm为宜)、高的上转换效率、易实现与生物分子的偶联、低毒或无毒[8]等条件。

制备纳米微粒的方法很多，如水热/溶剂热法、微乳液法、溶胶凝胶法、热分解法等。众多的制备方法中，热分解法和水/溶剂热法能够灵活控制晶粒生长，将晶粒制备成具有确定晶相、粒径、形貌、性能可控单分散性的纳米晶。水热/溶剂热法还有一特点：在反应物中加入PEI、PVP等，通过一次合成过程可同时实现纳米材料的制备及表面修饰[9]。于锋等[10]将LSS(液-固-溶)传统反应体系中的氢氧化钠更换为氨水，氨水与油酸生成新的表面活性剂，从而形成一种新的反应体系，在这种新体系中可控合成出了粒径小于10nm的稀土氟化物超细纳米晶。

热分解法是指在无水无氧的条件下将反应前驱体注射到高沸点的有机溶剂中，利用高温将前驱体迅速分解成核、生长，从而获得纳米颗粒的方法[11]。该方法中用到由非配位性溶剂和配位性溶剂组成的混合溶剂，如油酸-十八烯(OA/ODE)等。非配位性溶剂起到为反应提供高温环境的作用，而配位性溶剂则能吸附在纳米颗粒的表面，防止颗粒的进一步长大和聚集。

为获得良好的水溶性及生物相容性，上转换纳米粒子还需进行表面修饰，目前常用的修饰方法有表面钝化法、硅烷化法、配体交换法、配体氧化法、聚合物包覆法、层层自组装包覆法等。

2.1 表面钝化法

表面钝化法即在纳米颗粒表面包覆钝化层(如同质稀土层)，保护表面裸露的掺杂离子，以有效地抑制内部离子的激发能量转移到纳米颗粒表面，降低荧光淬灭，从而提高发光效率。例如，Mai等[12]制备的α-NaYF4:Yb,Er@α-NaYF4比未包覆的α-NaYF4:Yb,Er的上转换荧光效率增强了一倍。

2.2 硅烷化法

硅烷化法是利用硅烷前驱体的水解聚合在纳米颗粒表面通过共价键作用包覆SiO2层，最常采用的Stöber法[13]是利用正硅酸乙酯(TEOS)在碱性条件下水解缩合在纳米颗粒表面形成SiO2层，再利用氨基硅氧烷水解缩合进一步在SiO2层修饰出生物相容的氨基基团。该方法对工艺的要求较高，难以精确控制包覆层的厚度和形貌。反相微乳液法[14]是适用于憎水纳米材料的一种SiO2包覆方法，该方法需要在非极性溶剂中加入表面活性剂形成油包水的微乳液，四烷氧基正硅烷的水解和硅壳的生长在这些微小的水环境中进行。

2.3 配体交换法

表面配体交换法主要采用配位能力较强、带有亲水基团的多功能有机配体来取代纳米颗粒表面配位能力较弱、疏水性有机配体(如油酸、油胺)，最终制备出具有亲水性的纳米颗粒[15]。例如Kumar 等[16]采用3-巯基丙酸，通过表面配体交换法置换纳米颗粒表面的油酸，得到末端为羧基的可溶性稀土上转换纳米颗粒。

2.4 配体氧化法

配体氧化法是利用强氧化剂将上转换纳米颗粒表面的不饱和键氧化成活性官能团(如羧基、醛基等)的一种方法。大多数纳米粒子的表面包覆有油酸或油胺配体，故该方法适用于大部分的上转换纳米粒子的表面修饰。

2.5 聚合物包覆法

聚合物包覆法是利用两亲性聚合物(如PEG)的疏水端通过范德华力与上转换纳米颗粒表面的长烷基链结合包覆在纳米颗粒表面，亲水端与水相容，形成一个疏水/亲水的有机核-壳结构[17]。该方法可有效解决纳米颗粒的水溶性问题，减弱水对纳米颗粒的荧光淬灭效应。Yi 等[18]首先合成了六方晶相的NaYF4:Yb，Er和NaYF4:Yb，Tm 核壳结构的纳米粒子，然后在上述得到的核壳纳米粒子外层再包覆一层聚丙烯酸(PAA)。研究发现，PAA 包覆后的纳米粒子较NaYF4:Yb，Tm 核壳纳米粒子的上转换荧光性能提高了29.6倍，较NaYF4:Yb，Er 核壳纳米粒子的上转换荧光性能也提高了7.4倍。

2.6 层层自组装包覆(LBL)法

LBL法首先在疏水的稀土上转换纳米颗粒表面吸附一层带电聚合物，然后将其加入到带异种电荷的聚合物溶液中，这两类聚合物因带有异种电荷而相互吸引; 如此依次吸附，两种聚合物可在纳米颗粒的表面交替组装成有机壳层[19]，通过改变吸附层数可调控有机壳层厚度，从而优化稀土上转换纳米颗粒在水溶液中的稳定性和在生物体内的相容性。

3 上转换纳米荧光探针的应用

近年来，利用稀土上转换纳米晶作为生物荧光探针的研究成为荧光检测技术领域的热点[20]。其应用包括生物医学成像、生物医学检测、生物芯片等。

3.1 生物医学成像

吴笑峰等[21]采用热熔剂法制备了Yb3+和Er3+共掺杂的NaLuF4纳米晶，被用于西红柿细胞的标记成像，结果表明，被修饰后的NaLuF4纳米晶能很好地吸附在西红柿细胞壁，细胞形貌成像清晰，相比传统的切片透射光成像，荧光成像能够应用于活体，免除切片过程，这为生物医学的研究提供了新的成像途径。Xu等利用NaYF4:Yb,Er上转换纳米粒子与兔的抗-CEA8抗体偶联后，实现了对HeLa细胞的靶向免疫标记以及荧光成像[22]。此外，Liu等在上转换纳米粒子表面负载治疗药物，实现癌细胞的多功能靶向成像和治疗[23]。

3.2 生物医学检测

3.2.1 免疫层析技术

上转换免疫层析技术又称侧向流动技术，它把免疫上转换荧光纳米颗粒作为示踪分子应用于免疫层析，它在检测感染性细菌、病原体、病毒和食品中残留物以及肿瘤标志物方面的研究开发十分广泛。侧流免疫层析快速检测试纸是最常用的即时诊断装置之一，凭借快速的检测速度(<10 min)和极低的检测极限(1 ng/μL)，稀土上转换荧光探针在即时诊断器件开发应用中受到广泛关注[24]。

3.2.2 基于荧光共振能量转移(FRET)的检测

荧光共振能量转移(FRET)是指两个荧光发色基团在足够靠近时(距离在10 nm以内)，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠时，供体的能量向邻近的受体分子转移，即发生能量共振转移的技术。上转换纳米颗粒的荧光共振能量传递在检测蛋白质，核酸方面具有广泛的应用。利用这一原理，Zhang等[25]开发了高灵敏度、高特异性的单链核酸生物探针。

3.3 生物芯片

荧光探针是生物芯片技术中使用的示踪材料，生物芯片中常用的荧光探针存在着光漂白、激发光能量高因而背底高等缺点，该类探针与其匹配的扫描仪价格太贵，因而严重阻碍了生物芯片技术的广泛应用。上转换纳米荧光探针及其匹配的扫描设备将弥补其他荧光探针性能上的不足并降低原料和设备的成本[26]。

4 上转换纳米荧光探针的研究展望

上转换纳米荧光探针近几年的研究取得了突飞猛进的进步，但其实际应用仍然存在多种障碍，未来的研究可着重从以下几方面寻求突破：

4.1 制备与修饰方法上的突破

各种制备与修饰方法还存在这样或那样的缺陷，有些实现复杂，步骤繁多；有些对制备的条件或环境要求苛刻，技术参数难以控制；有些需要的原料昂贵，重现性差，对环境造成污染；有些制备出的样品无法满足实际应用需求。如何改进或综合各种制备与修饰技术，或研发新的制备与修饰方法，需要科研人员突破。

4.2 超小、高量子产率、水溶性、生物相容性纳米探针的可控合成

如何采用更加简便绿色的方法合成出超小、高量子产率、水溶性的上转换发光纳米颗粒，如何对上转换发光纳米颗粒表面改性使之兼具高生物相容性、高稳定性、高发光效率，将是今后的研究重点。

4.3 上转换荧光探针的毒性研究

颗粒的尺寸、组成等都会影响其在生物体系中的毒性水平、生物分布和代谢途径，对细胞和活体组织的毒性以及在活体内的代谢情况，都需要进行研究。

4.4 多通道荧光探针的开发

多通道荧光探针可同时检测多种荧光信号，例如，时间分辨荧光探针需要紫外可见光激发，上转换荧光探针需要近红外光激发，这两类探针各具优势，如何制备出兼具多重检测性能的荧光探针，为生物荧光检测提供多通道检测方法。

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Preparation andApplication of Rare-earth Upconversion Fluorescent Probe

ZhongCheng

(DepartmentofBasicEducation,DazhouVocationalandTechnicalCollege,Dazhou635001,Sichuan,China)

In this paper, the upconversion luminescence mechanism is discussed, the upconversion nano fluorescent probe preparation technology and surface modification methods were summarized, biomedical applications of upconversion fluorescent probes were analyzed, and the future research directions are prospected.

upconversion nanoparticles; fluorescent probe; biomedical applications; preparative technique; surface modification