妊娠期肝内胆汁淤积症患者人类白细胞抗原G与Th1/Th2细胞因子的相关性

浦雯绮++++++蔡奚梅++++++陆丽丹

[摘要] 目的 探討妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）患者人类白细胞抗原G（HLA-G）与Th1/Th2细胞因子的相关性。 方法 选取2014年1月～2015年12月在江苏省常熟市中医院确诊的90例ICP剖宫产引产孕妇娩出的胎盘组织作为观察组，另选取同期90例因脐带绕颈或胎儿臀位行剖宫产的正常孕妇娩出的胎盘组织作为对照组，采用免疫组化法对胎盘组织中HLA-G表达情况进行检测，检测孕妇血清总胆汁酸（TBA）、白细胞介素-4（IL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，比较两组TBA、IL-4和TNF-α水平及胎盘组织中HLA-G表达，并分析HLA-G与Th1/Th2细胞因子相关性。 结果 观察组TBA、TNF-α及TNF-α/IL-4水平均高于对照组，IL-4水平低于对照组（P < 0.01）。观察组胎盘组织中HLA-G阳性表达程度明显低于对照组（P < 0.01）。ICP患者胎盘组织中HLA-G与TNF-α和TNF-α/IL-4呈负相关（r=-0.751，P=0.024；r=-0.235，P=0.000），与IL-4无明显相关性（P=0.305）。TBA与HLA-G呈负相关（r=-0.766，P=0.013），与TNF-α和TNF-α/IL-4呈正相关（r=0.821，P=0.033；r=0.731，P=0.024），与IL-4无明显相关性（P=0.479）。 结论 HLA-G下降可能导致ICP患者TNF-α水平升高，使Th1表达处于优势状态，导致Th1/Th2失衡，促使母体对胎儿产生排斥。

[关键词] 妊娠期肝内胆汁淤积症；人类白细胞抗原G；总胆汁酸；白细胞介素-4；肿瘤坏死因子-α

[中图分类号] R714.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（b）-0090-04

[Abstract] Objective To explore the relationship between human leukocyte antigen G （HLA-G） and Th1/Th2 cytokines in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy （ICP）. Methods 90 cases of placental tissues of ICP diagnosed and treated with cesarean delivery of the placenta induction of labor in Hospital of Traditional Chinese Medicine in Changshu City， Jiangshu Province from January 2014 to December 2015 were selected as observation group， and another 90 cases of placental tissues of normal pregnant women undergoing of fetal breech cesarean delivery due to umbilical cord around the neck or breech presentation in the same period were selected as control group. The immunohistochemistry method was used to detect the expressions of HLA-G in placental tissues. The levels of serum total bile acid （TBA）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-4 （IL-4） were detected in the pregnant women between two groups. The levels of TBA， IL-4 and TNF-α and the expressions of HLA-G were compared between two groups， then the relationship between HLA-G and Th1/Th2 cytokines was analyzed. Results The levels of TBA， TNF-α and TNF-α/IL-4 in observation group were higher than those in control group， and the IL-4 of observation group was lower than that of control group （P < 0.01）. In the placental tissues of observation group， the degree of positive expression in HLA-G was obviously lower than that in control group （P < 0.01）. The expression of HLA-G was negatively correlated with TNF-α and TNF-α/IL-4 in the placental tissues of patients with ICP （r=-0.751， P=0.024； r=-0.235，P=0.000） and there was no significant correlation between HLA-G and IL-4 （P=0.305）. TBA was negatively correlated with HLA-G （r=-0.766， P=0.013）， positively correlated with TNF-α and TNF-α/IL-4 （r=0.821， P=0.033； r=0.731， P=0.024）， without significant correlation with IL-4 （P=0.479）. Conclusion HLA-G decline may lead to rising of TNF-α level in patients with ICP， and Th1 expression in the dominant state leads to imbalance of Th1/Th2.

[Key words] Intrahepatic cholestasis of pregnancy； Human leukocyte antigen G； Total bile acid； Interleukin-4； Tumor necrosis factor-α

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）多发于妊娠中晚期，属于妊娠期间特有的肝脏疾病，主要症状为皮肤瘙痒，生化特征为肝酶和胆酸等异常，通常会引起宫内窘迫、早产及新生儿窒息或死亡等不良妊娠结局[1-3]。人类白细胞抗原G（human leukocyte antigen G，HLA-G）能够通过与T细胞和NK细胞表面的抑制性受体相结合，抑制这两种细胞的杀伤活性，对于正常妊娠的维持和母胎免疫耐受有重要作用，如果表达异常，会造成病理性妊娠的发生。在正常妊娠状态下，为避免胎儿受母体排斥，母体中Th2免疫占有绝对优势，避免Th1参与的细胞免疫。但是有研究表明，ICP患者母体中Th1/Th2型细胞因子已经失去平衡性，转向以Th1为主的细胞免疫[4]。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）属于Th1型细胞因子，白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）属于Th2型细胞因子。所以本研究进行Th1/Th2型细胞因子TNF-α/IL-4水平和总胆汁酸（total bile acids，TBA）水平检测，同时研究HLA-G的表达，探讨ICP患者HLA-G与Th1/Th2细胞因子的相关性，以期为ICP的发病机制提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月～2015年12月在江苏省常熟市中医院（以下简称“我院”）确诊的90例ICP剖宫产引产孕妇娩出的胎盘组织作为观察组，ICP孕妇年龄21～35岁，平均（28.46±4.38）岁；孕龄31～40周，平均（35.27±3.66）周。另选取同期90例因脐带或胎儿臀位行剖宫产的正常孕妇娩出的胎盘组织作为对照组，正常孕妇年龄22～37岁，平均（29.51±5.35）岁；孕龄30～39周，平均（36.01±2.79）周。两组孕妇年龄、孕龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准同意。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①所有研究对象均为单胎妊娠，初产妇；②年龄22～37岁；③孕龄30～40周；④均行剖宫产结束妊娠；⑤签署研究知情书表示愿意参加本次研究。排除标准：①合并有肝肾功能损伤、妊娠高血压、冠心病或其他心脑血管疾病、多囊卵巢综合征者；②胎儿发育异常、胎膜早破或产前感染、产前出血；③有死胎或死产史者；④有精神或神经性疾病；⑤有ICP无法解释的生化、血尿等检测异常现象；⑥临床资料不全者。

1.3 方法

1.3.1 IL-4、TNF-α和TBA水平测定 产前晨起空腹抽取肘静脉血4 mL，分别置于普通试剂管和无菌促凝管中，2 mL/管。对普通试剂管中血液进行TBA浓度测定。无菌促凝管中血液静置2 h后，水平离心机分离血清，3000 r/min，共10 min，留取血清，-20℃冰箱保存，然后采用酶联免疫吸附试验检测IL-4和TNF-α水平。相应试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3.2 HLA-G蛋白表达 ①胎盘：分娩后直接进行新鲜胎盘组织采集，母面脐带附着处取2 cm×2 cm大小的全层组织，0.9%氯化钠溶液反复洗净，10%甲醛溶液中固定，-80℃冰箱保存，常规石蜡包埋。②免疫组化法：采用免疫组化法将蜡块进行厚度为4 μm连续切片，取其中1片进行免疫组化染色；一抗（购自美国BD Pharmingen生物技术公司）工作浓度根据预实验结果调整，1∶100；实验步骤参照《现代分子生物学试验手册》[5]，分别对切片进行梯度水化、抗原修复、室温孵育、磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗等；两组切片均在相同的试验条件与步骤下进行，免疫组化染色程序严格按照试剂盒说明方法染色，已确定为阳性切片，阴性对照滴入PBS代替一抗，若整片未见棕色颗粒，则说明本次试验染色结果可靠；显微镜下（深圳市深视光谷光学仪器有限公司，型号：SGO-200UVPX）观察每张切片选取至少5个视野，根据染色强度和阳性细胞所占比例进行判断。③HLA-G病理分析：HLA-G的阳性标记为淡棕色、棕色或深棕色颗粒。阳性细胞占比评分：≤5%为0分；>5%～25%为1分；>25%～50%为2分；>50%～75%为3分；>75%为4分。染色强度评分：不着色，0分；淡棕色，1分；棕色，2分，深棕色，3分；两项评分相加0～1分陰性；2～3分弱阳性（+）；4～5分中度阳性（++）；6～7分强阳性（+++）。阳性表达率为阳性标本数在总标本数中所占比例。

1.4 观察指标

①比较两组TBA、IL-4、TNF-α及TNF-α/IL-4水平和HLA-G表达情况；②分析ICP患者HLA-G与Th1/Th2细胞因子的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，等级资料采用秩和检验，相关性采用Pearson线性相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇外周血血清细胞因子水平比较

观察组外周血TBA、TNF-α及TNF-α/IL-4水平均高于对照组，IL-4水平低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 两组HLA-G表达情况比较

观察组胎盘组织中HLA-G阳性表达程度明显低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 HLA-G与Th1/Th2细胞因子及TBA相关性

经分析，ICP患者胎盘组织中HLA-G与TNF-α和TNF-α/IL-4呈负相关（r=-0.751，P=0.024；r=-0.235，P=0.000），与IL-4无明显相关性（P=0.305）。TBA与HLA-G呈负相关（r=-0.766，P=0.013），与TNF-α和TNF-α/IL-4呈正相关（r=0.821，P=0.033；r=0.731，P=0.024），与IL-4无明显相关性（P=0.479）。

3 讨论

正常妊娠的维持需要母体作为同种半异体移植物的胚胎组织产生免疫耐受，这是母体在妊娠期自身免疫调节的结果。有关研究表明，母体与胚胎之间的免疫应答主要发生于胎盘局部，而妊娠是否成功的关键在于胎盘滋养细胞与脱膜层免疫微环境的相互作用[6-7]。哺乳动物的胚胎发育最初阶段是存在抗原特性的，且该特性隨着胚胎的不断发育而逐渐增强，但由于母体与胚胎基因的不一致性，导致在随后的妊娠中胚胎和其滋养细胞表达甲胎蛋白抗原、胚胎血型抗原等同种异体抗原[8-9]。胚胎的滋养层细胞可直接与母体蜕膜组织的免疫细胞接触，而滋养细胞的抗原特性将直接对母体和胚胎的免疫反应造成影响。经典的HLA-A、B抗原在母胎界面的绒毛外滋养细胞不表达，但非经典的HLA-G于滋养细胞表达。有研究证实，HLA-G是一种免疫抑制因子，在妊娠过程中对有父源性人类白细胞抗原的胎儿具有保护作用，从而保证妊娠顺利进行[10-11]。

蜕膜层免疫微环境与胎盘滋养细胞的相互作用是妊娠成功与否的决定因素，母体滋养层细胞能够与蜕膜组织的免疫细胞进行接触，其抗原性可以对胚胎的免疫反应产生直接影响。有学者研究表明，HLA-G正是免疫抑制因子中的一员，可以减少母体免疫细胞对滋养细胞的攻击，同时对滋养细胞的分化和侵入行为进行调节，保证妊娠的顺利进行[12]。有国外学者对试管婴儿胚胎进行研究，发现胚胎想要植入成功，胚胎培养液中必须有HLA-G表达，提示HLA-G是妊娠正常进行的前提[13]。所以当HLA-G的表达水平降低时，很容易导致病理妊娠的发生。本研究结果显示，ICP患者胎盘组织中HLA-G的阳性表达程度显著低于对照组，通常孕激素对于HLA-G的表达有上调作用，此时考虑ICP患者发生孕激素异常代谢。另外，在妊娠中期，血红素加氧酶对绒毛外滋养细胞的生长有调节作用，HLA-G正是从绒毛外滋养细胞中提取出来的，所以HLA-G表达降低与血红素加氧酶降低也有密不可分的关系。

临床认为，偏向Th2细胞因子参与的体液免疫才能保证妊娠的正常维持，且只有Th1细胞因子水平降低并向Th2方向转化，才能使胎儿不被母体排斥[14-15]。因为妊娠期间，Th1细胞因子具有细胞毒效应。有动物实验结果显示，将TNF-α、IFN-γ、IL-2注入怀孕小鼠体内，会导致小鼠流产，妊娠终止，而且其胎盘组织中的TNF-α、IFN-γ和IL-2细胞因子明显增加[16]。Th2细胞中IL-4因子可对Th1诱导下NK细胞的活化产生抑制作用，调节胎盘生长，最终达到防止早产和流产的目的。如果外周免疫、母胎界面的激素网络、滋养层主要组织兼容性复合物及胎盘分泌的保护抗体和抑制因子等其中一项有异常反应，都会导致母体免疫功能紊乱，Th1/Th2平衡性丧失，导致妊娠并发症及妊娠失败的发生。有学者研究指出，在肝脏损伤的过程中，TNF-α会有所参与[17]。TNF-α可以促进中性粒细胞活化，提高其在肝脏中的聚积，释放氧自由基和蛋白酶等导致干细胞损伤；TNF-α促使氧自由基产生，造成脂质过氧化物堆积，引起肝脏细胞氧化损伤；TNF-α能够促进单核细胞和中性粒细胞与内皮细胞之间的黏附，通过提高免疫反应或直接杀伤力引起内皮细胞损伤[18-20]。这些损伤均会不同程度地损伤母体，造成不良妊娠结局。本研究结果发现，肝脏损伤指标TBA水平测量显示，观察组患者明显高于对照组，并且TBA与TNF-α之间呈正相关，表明随着TNF-α升高，孕妇肝脏损伤后程度越重，肝内胆汁淤积症越严重。而TBA与IL-4无明显相关性，说明ICP患者存在Th1/Th2失衡，且向Th1方向偏移。

在HLA-G被不同细胞受体识别时，能够调节母体单核巨噬细胞、外周血单个核细胞、蜕膜细胞、胎盘滋养层、Th细胞及NK细胞等分泌出不同的Th因子，从而促进和保护胚胎和滋养细胞的发育生长[21]。有学者研究HLA-G在母体中的影响发现，HLA-G对PBMCs细胞中IL-4产生有促进作用，并抑制蜕膜细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌，得出HLA-G能通过对PBMCs细胞因子和蜕膜细胞因子的调节，保持Th1/Th2平衡[22]。另有国外学者指出，不同浓度HLA-G对细胞因子的影响程度不同，低浓度状态下，可使Th1型细胞如TNF-α等增加，高浓度状态下又对Th2细胞因子的产生有诱导作用[23]。本研究中，观察组HLA-G与TNF-α、TBA和TNF-α/IL-4呈负相关，提示IPC患者HLA-G下降，则Th1型细胞因子水平上升，肝内胆汁淤积症发生率升高。

综上所述，ICP胎盘组织中HLA-G表达下降会导致Th1/Th2失衡，临床可以选用对HLA-G表达有上调作用的药物如地米塞松等进行ICP治疗。

[参考文献]

[1] 何丽，罗丹，刘毅，等.500例妊娠期肝内胆汁淤积症围生结局分析[J].实用妇产科杂志，2012，28（4）：282-284.

[2] 任丽平，徐军，胡峥.多烯磷脂酰胆碱联合茵栀黄和谷胱甘肽治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的研究[J].临床和实验医学杂志，2016，15（10）：999-1001.

[3] 吴绍洋，杨新明.血清甘胆酸检测在妊娠期肝内胆汁淤积症中的应用价值[J].中国当代医药，2016，23（16）：41-43.

[4] 缪玉辉，孙瑞芳.茵陈蒿汤对妊娠期肝内胆汁淤积症患者Th1/Th2平衡的影响[J].中国中西医结合杂志，2014， 34（8）：1017-1018.

[5] 张维铭.现代分子生物学实验手册[M].2版.北京：科学出版社，2007：78-82.

[6] 周兰，漆洪波，罗欣.早发型妊娠期肝内胆汁淤积症患者的临床生化特点及围产结局分析[J].中华妇产科杂志，2013，48（1）：20-24.

[7] 杜巧玲，段涛.胆汁酸与妊娠期肝内胆汁淤积症发病机制关系的研究进展[J].中华妇产科杂志，2013，48（2）：141-143.

[8] 孔艳，孔祥.妊娠期肝内胆汁淤积症免疫因素的研究进展[J].中华妇幼临床医学杂志：电子版，2015，11（6）：798-800.

[9] Geenes V，Chappell LC，Seed PT，et al. Association of severe intrahepatic cholestasis of pregnancy with adverse pregnancy outcomes：a prospective population-based case-control study[J]. Hepatology，2014，59（4）：1482-1491.

[10] 李明，吳晶，邢爱耘.人类白细胞抗原F在妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘中的表达及意义[J].实用妇产科杂志，2015，31（7）：26.

[11] Wikstrm Shemer E，Marschall HU，Ludvigsson JF，et al. Intrahepatic cholestasis of pregnancy and associated adverse pregnancy and fetal outcomes：a 12-year population-based cohort study[J]. BJOG，2013，120（6）：717-723.

[12] 陈国珍，贾支俊.妊娠期肝内胆汁淤积症严重程度与胎儿生长发育状况关系研究[J].山西医药杂志，2010，39（7）：658-659.

[13] Zambra FM，Biolchi V，de Cerqueira CC，et al. Immunogenetics of prostate cancer and benign hyperplasia-the potential use of an HLA-G variant as a tag SNP for prostate cancer risk[J]. HLA，2016，87（2）：79-88.

[14] 王增芳，王萍萍，王增艳，等.PTPRO对妊娠期肝内胆汁淤积症患者Th1/Th2细胞偏倚的影响[J].江苏医药，2015，41（18）：2157-2159，2110.

[15] 朱琴玲，李莉平，秦晓黎，等.通过TLR9途径活化巨噬细胞导致小鼠流产的机制研究[J].现代免疫学，2011， 31（6）：473-477.

[16] 宋静，王黎丽，侯昕，等.调节性T细胞在poly I：C/D-GalN诱发的肝脏损伤中的免疫调节作用[J].中国免疫学杂志，2014，30（1）：24-29.

[17] 吴永强，梁龙，石桂秀.CD38蛋白下调炎症因子的表达减轻脂多糖联合D-氨基半乳糖诱导的急性肝脏损伤[J].细胞与分子免疫学杂志，2014，30（10）：1009-1012.

[18] Carlsson AC，stgren CJ，Nystrom FH，et al. Association of soluble tumor necrosis factor receptors 1 and 2 with nephropathy，cardiovascular events，and total mortality in type 2 diabetes[J]. Cardiovasc Diabetol，2016，15（1）：40.

[19] 王崇，姜艳芳，金清龙，等.肝病患者血清Gc球蛋白和细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10检测及临床意义[J].中国实验诊断学，2010，14（6）：870-872.

[20] 张展，李莹，张琳琳，等.父源性HLA-G基因14bp缺失多态性与早发型重度子痫前期的相关性研究[J].中国妇幼保健，2012，27（11）：1710-1713.

[21] 张娣，单士刚，陈俊，等.可溶性HLA-G二聚体在体外对M1型巨噬细胞极化抑制作用的研究[J].免疫学杂志，2013，29（9）：818-821.

[22] 曾宪成，张彤，李华，等.肝癌Hep3B细胞HLA-G过表达对NK细胞体外杀伤作用的影响[J].中国病理生理杂志，2012，28（4）：613-618.

[23] Svajger U，Obermajer N，Jeras M. IFN-γ-rich environment programs dendritic cells toward silencing of cytotoxic immune responses[J]. Leukoc Biol，2014，95（1）：33-46.