海南冬青组培快繁体系的建立

姚绍嫦+谭文明+蓝祖栽

摘要：建立海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）的组培快繁技术体系。以海南冬青成熟种子为材料，以MS、1/2MS为基本培养基，采用正交试验设计法研究不同植物生长调节剂组合对海南冬青种子萌发、初代诱导、增殖培养、生根培养的影响，筛选出组培快繁各环节的最佳培养基配方。研究结果，海南冬青种子萌发的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L，萌发率达90%以上；丛生芽诱导的最适培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导不定芽数为28.56个；最佳继代增殖培养基为MS+6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L，20 d增殖系数为7.30；最适的生根培养基为1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L，生根率为91.33%，在菜园土-细河沙（3 ∶1）中移栽成活率为90%。表明本组培快繁技术体系不但增殖系数高，而且组培苗质量好，可为海南冬青的规模化生产提供优质种苗与技术指导。

关键词：海南冬青；组培快繁；丛生芽；正交试验

中图分类号：S567.1+90.43 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2017）01-0022-04

海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）为冬青科冬青属常绿小乔木，其干燥叶加工炮制而成的广西少数民族民间草药山绿茶，被收载于《广西中药材标准》（1990年版）[1]，具有清热解毒、消肿止痛、活血通脉的功效，主要用于降血压、降血脂、降胆固醇以及治疗冠心病、脑血管意外所致的偏瘫、风热感冒、肺热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢疾等病症[2]。以山绿茶为主要原料制成的制剂作为降压、降脂的常用中成药，具有使用量较大、疗效确切、毒副作用小、产品独特等优点，在广西等地区市场占有率高，有较好的经济效益与发展前景。山绿茶是山绿茶降压片、决明山绿茶、山绿茶降压胶囊等产品的主要原料，其中山绿茶降压片已被收载于中药部颁标准（标准编号：WS3-B-2838-98）。目前，山绿茶以采集野生资源为主，随着近年来需求量的不断上升，野生资源已濒临灭绝，难以满足制药企业的需求[3]，迫切需要开展人工栽培，但目前对山绿茶的研究主要集中在其制剂的临床疗效[4-5]、含量测定和炮制方法[6-7]、化学成分与药理活性[8-9]等方面，迄今尚未发现海南冬青有关组织培养方面的研究报道。在自然状态下，海南冬青主要依靠种子繁殖，由于果实经常在成熟期被鸟类啄食而造成种子大量损失，以及种子具有休眠特性，在自然状态下萌发率低而导致种子繁殖速度缓慢。为了更好地开发和利用海南冬青，本研究通过组培快繁的技术手段，建立组培快繁的技术体系，为开展海南冬青的规模化人工栽培提供优质种苗与技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

海南冬青的成熟浆果于2014年10月采自广西南宁地区武鸣县大明山风景区，标本经广西中医药研究院鉴定为海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）。

1.2 方法

1.2.1 外植体选择与灭菌 在海南冬青果实成熟期（每年10—12月），选取完全成熟的红色浆果，将果皮搓烂，流水冲洗果皮，挑选沉淀的种子作为外植体进行灭菌。在超净工作台上，用纱布袋将种子包好，用75%乙醇（体积分数）浸泡纱布袋5～10 s后，再用0.1% HgCl2水溶液（质量分数）分别浸泡6、8、10、12 min灭菌种子，用无菌水摇荡洗涤4次，用镊子打开纱布袋，再用无菌吸水纸将种子表面水分吸干后，将种子夹起接种到种子萌发培养基上培养。接种后15 d统计污染情况。

1.2.2 种子萌发培养 将种子接种到含不同质量浓度6-BA与GA3组合的种子萌发培养基上，每处理10瓶，每瓶10粒种子，记录种子萌发情况，30 d后统计种子萌发率，筛选出适合打破休眠促进萌发的培养基。

1.2.3 初代诱导培养 将萌发的幼苗切取含2片真叶的不定芽进行丛生芽诱导培养，采用L9（34）正交试验，在MS基本培养基上以6-BA（A）（1.0、2.0、3.0 mg/L）、KT（B）（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（C）（0.1、0.2、0.5 mg/L）3种不同类型的生长调节剂的3个水平进行正交试验，对海南冬青丛生芽诱导培养基进行优化，每种培养基20瓶，每瓶接种3个芽，30 d 统计不定芽诱导数量，比较不同组合诱导不定芽的差异，筛选出适合的初代诱导培养基。

1.2.4 继代增殖培养 将初代培养获得的丛生芽切下单个芽进一步转接到继代培养基中进行增殖培养，以MS为基本培养基，添加不同质量浓度6-BA（2.0、2.5、3.0 mg/L）、KT（0.50、0.75、1.00 mg/L）、NAA（0.1 mg/L）组合，每处理10瓶，每瓶3个芽，观察记录芽的生长情况，20 d统计增殖情况，计算芽增殖系数，筛选出继代增殖的最佳培养基。

1.2.5 生根培养 切取长约2 cm的不定芽为生根材料，在1/2MS基本培养基上，添加不同质量浓度NAA（0、0.2、0.5 mg/L）与IBA（0、0.50、0.75、1.00 mg/L）组成10个处理，每处理10瓶，每瓶5个芽，20 d统计不同处理的生根率与平均生根数，考察2种生长素组合对生根的影响。

1.2.6 培养条件 培养基均附加3.0%蔗糖和0.5%瓊脂，pH值5.8～6.0，配制分装后，于121 ℃灭菌20 min。培养条件为26 ℃、光照强度2 000 lx、光照时间10 h/d。

1.2.7 炼苗移栽 待组培苗生根培养30 d后进行炼苗移栽，将瓶盖打开炼苗3～5 d，然后用镊子将瓶苗取出，用流水洗去粘在根部的琼脂，移栽到经过消毒的泥炭土、河沙、菜园土、泥炭土-河沙（3 ∶1）、菜园土-河沙（3 ∶1）5种不同基质上，移栽后用遮阳网遮阴，覆膜保湿，视生长情况逐渐撤去薄膜，20 d时统计不同基质的移栽成活率。

1.3 数据统计与分析

试验所得数据用Excel和SPSS17.0方差分析软件处理。

萌发率=30 d后萌发种子数/接种种子数×100%；芽增殖系数=（20 d后不定芽数量-接种时不定芽数量）/接种时不定芽数量；生根率=生根苗数/接种苗数×100%；平均生根数=总生根数/接种总数；成活率=成活苗数/移栽苗数×100%。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌时间筛选

用0.1% HgCl2溶液对海南冬青种子进行灭菌，从表1可以看出，用0.1% HgCl2溶液灭菌10 min以上，效果较好，成功率显著高于用0.1% HgCl2溶液灭菌时间少于10 min的处理，成功率达95%。HgCl2作为一种灭菌剂，在对外植体进行灭菌的同时对其生活力也具有一定的伤害作用，灭菌时间越长对其伤害的程度越大，在取得相同灭菌效果的情况下，我们认为灭菌时间越短越有利于外植体生活力的保持。当灭菌时间低于10 min时，污染率较高，灭菌6 min时外植体全部污染。因此，用0.1% HgCl2溶液灭菌10 min的效果最佳。

2.2 种子萌发培养

将种子接种到含不同质量浓度6-BA与GA3组合的种子萌发培养基上培养，从表2可以看出，灭菌后的种子接种在不同处理的培养基上均能萌发，但是萌发情况差异较大，在添加GA3的培养基上萌发情况较好，说明GA3能有效地打破海南冬青种子的休眠，促进种子萌发。随着GA3浓度的增加，种子萌发率反而出現下降现象，当6-BA 0.5 mg/L+GA3 05 mg/L时，种子初始萌发时间最短，且萌发率最高，达85%，极显著高于其他处理，达到较好的种子萌发效果。种子在6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L组合的培养基上培养 15 d 后开始萌发，20 d后胚芽出现，并且开始迅速生长（图1-A），至35 d时，种子苗高已1～2 cm（具2张以上真叶），此时，切取含2张真叶的不定芽进行丛生芽诱导培养。因此，适合海南冬青种子萌发的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+GA30.5 mg/L。

2.3 初代诱导培养

将种子萌发后切取的不定芽转接到以MS为基本培养基，不同质量浓度6-BA与NAA配比的初代诱导培养基上进行丛生芽诱导培养，培养过程中不定芽继续生长，无愈伤组织产生。培养10 d后，不定芽的腋芽开始不断分化而形成大量丛生芽（图1-B），培养30 d后，大量丛生芽使得不定芽呈簇状结构，此时可进行继代转接（图1-C）。

从表3可以看出，在初代诱导培养过程中，不同激素组合对海南冬青丛生芽的诱导效果差别很大。在6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L组合下，不定芽数量最多，达到28.56个。正交试验设计的极差R大小决定各生长调节剂对不定芽诱导影响程度依次为A>B>C，即6-BA>KT>NAA，最优组合为A3B2C1。由方差分析可知，6-BA对丛生芽的诱导作用达到显著水平，KT、NAA对丛生芽的诱导作用均不显著（表4）。因此，6-BA为主要因素，KT、NAA为次要因素。在6-BA浓度保持在0～3.0 mg/L之间时，不定芽数量与浓度成正比，适当高浓度的6-BA对丛生芽的产生起到积极作用。从不定芽生长状况来看，各处理均无玻璃化现象发生，6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L处理组合不定芽长势明显比其他处理强，因此，综合考虑正交试验结果与不定芽生长状况，采用6-BA 3.0 mg/L、KT 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L组合，以此组合进行海南冬青丛生芽诱导可获得不定芽更多的数量与更优的品质。

2.4 继代增殖培养

将初代培养获得的丛生芽切下单个不定芽转接到继代培养基中进行增殖培养，在充分考虑初代诱导培养基中各激素影响的情况下，以MS为基本培养基，添加不同质量浓度6-BA、KT与0.1 mg/L NAA组合，对继代增殖培养基进行优化。

从表5可以看出，不同质量浓度的6-BA与KT组合获得的芽增殖系数差异较大，6-BA是增加芽增殖系数的主导因素，当6-BA浓度为2.5 mg/L时，与不同浓度的KT组合均获得较高的芽增殖系数，其中以6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L组合获得最好的效果，培养20 d后实现芽增殖系数7.30倍，极显著高于其他处理，且不定芽生长健壮，展叶良好，长势快，有利于下一步生根诱导（图2-A）。当6-BA浓度增加到3.0 mg/L时，芽增殖系数反而出现下降的现象，且不定芽的质量也有所下降，丛生芽容易出现簇状而抑制了芽的伸长生长，不利于下一步生根培养（图2-B）。当6-BA浓度相同时，KT浓度的增加对芽增殖系数的影响差异不大。因此，MS+6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培养基是最适宜海南冬青丛生芽增殖的培养基。

2.5 生根培养

切取长约2 cm的不定芽为生根材料，在1/2MS基本培养基上添加不同浓度NAA或IBA进行生根培养，20 d后统计生根率及平均生根数（表6）。不定芽转接7 d后根原基开始形成， 20 d后苗生长良好，根长且粗壮，茎基部无愈伤组织产生。不同浓度生长调节剂组合对不定芽生根率的影响较明显，IBA浓度相同时，NAA浓度增加对生根率与平均生根数的增加均有促进作用，根较细长。2种生长素同时添加出现了促进生根的叠加效应，生根率、平均根数均比单独使用IBA时高，当IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L组合时，生根率为91.33%，平均生根数为5.90条，二者均达到最大值，极显著高于其他处理，且根粗壮、发达，有利于下一步移栽成活（图3-A、图3-B）。因此，1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L 较适合海南冬青诱导生根。

2.6 试管苗的移栽

待组培苗生根培养30 d后进行炼苗移栽。从表7可以看出，试管苗在不同基质上的成活率由高到低依次为菜园土-河沙（3 ∶1）>菜园土>泥炭土>泥炭土-河沙（3 ∶1）>河沙，其中，试管苗在菜园土-河沙（3 ∶1）的基质中移栽30 d后成活率达到90%（图3-C），极显著高于其他处理。移栽180 d后，植株高超过15 cm，生长良好（图3-D），可进行大田移栽。因此，试管苗移栽最适宜的基质为菜园土-河沙（3 ∶1）。

3 讨论

多数冬青属植物的种子具有休眠特性而影响其快速繁育，其休眠期长短因种而异，如大叶冬青（Ilex latifolia）种子的休眠期長达3年[10]。本课题组在前期研究中发现海南冬青种子具有短暂的休眠期，秋季采集的种子需在4 ℃低温贮藏3个月方可有效解除休眠[3]。本试验中，为了解除海南冬青新鲜种子的休眠，我们在种子萌发培养基中添加GA3，结果表明，GA3能有效地打破海南冬青种子的休眠，促进种子萌发，当6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L时，种子初始萌发时间最短，且萌发率最高，达85%，达到较好的种子萌发效果，与前人采用GA3在解除大果冬青与狭叶冬青等同属植物的种子休眠上取得较好的积极作用的研究结果[11-12]一致。

在植物组织培养中，外植体初代诱导的结果除了与外植体本身取材有关，也与培养过程中使用的生长调节剂密切相关[13]。目前尚未发现海南冬青组织培养方面的研究报道，同属植物组织培养方面，研究报道也较少。王慧瑜等以大叶冬青当年生嫩枝为外植体，以BA与NAA或者IBA组合实现了丛生芽的诱导与增殖培养[14]。杨灿等以红果冬青的茎段进行组培试验，诱导出丛生芽，并在低浓度的BA与KT配合下实现芽的继代增殖[15]。同属植物多数是以茎段为外植体直接诱导不定芽，我们前期研究发现，海南冬青植株内含多酚类物质较多，选用其嫩芽或者带芽茎段作为外植体十分容易褐化而不利于不定芽诱导，种子是较理想的外植体材料，具有容易消毒、生长力旺盛的特点。本试验采用种子萌发形成的无菌苗切去根部后作为材料进行不定芽的诱导与增殖。植物生长调节剂种类和质量浓度对海南冬青的不定芽诱导与增殖有较大影响。使用6-BA、KT与NAA组合进行初代诱导与继代增殖筛选，6-BA对丛生芽的诱导作用达到显著水平，是海南冬青丛生芽形成与增殖的关键因素，其中以6-BA 3.0 mg/L 的诱导作用最强，在一定范围内不定芽的诱导数量与增殖系数随着6-BA浓度的增加而增加。KT作为促进侧芽发生发育的外源性细胞分裂素，组织培养中主要用于促进细胞分裂和分化，与五指毛桃[16]类似，在培养基中配合使用低浓度的KT对海南冬青不定芽的诱导与增殖均具有较大的促进效应。高浓度的细胞分裂素与低浓度的NAA配合使用，有利于不定芽的分化，NAA 0.1 mg/L与高浓度的6-BA、KT组合时达到较好的效果，与杨灿等在红果冬青的研究结果相符。在本试验中，以种子萌发产生的无菌苗进行丛生芽诱导，成功诱导出较多的不定芽（不定芽数量28.56个），幼小的不定芽继代培养20 d后又获得7.30的增殖系数，而且在培养过程中无愈伤组织产生，实现了以芽繁芽的技术特点，在有效减少变异的同时大大提高了繁殖的速度。

海南冬青不定芽在附加不同质量浓度IBA或NAA的 1/2MS培养基上均可生根，且2种生长素同时添加出现了促进生根的叠加效应，其中较适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L，培养20 d后可以获得再生植株，生根率达91.33%。在不添加生长素类植物生长调节剂的空白对照中，未发现生根，说明生长素类对海南冬青生根起到了促进作用。基质的选择对于试管苗的移栽成功与否也十分重要，适宜基质可以确保较高的试管苗移栽成活率。菜园土肥力较高，团粒结构好，但是干时表层易板结，湿时通气透水性差；河沙通气透水性好，但是肥力与保水性较差。本试验把这2种基质按3 ∶1的比例混合，可有效弥补这2种基质的不足，在海南冬青试管苗移栽上取得了较好的效果，移栽成活率达到90%。

利用组织培养技术能生产优质种苗，但组培苗能否在生产上迅速应用推广，与其移栽的便捷性、成活率、培养成本等密切相关[17]。本研究通过对海南冬青组培快繁过程中各技术环节的影响因子进行试验与优化，筛选出海南冬青种子萌发、不定芽诱导、增殖、生根培养的最佳培养基，建立了海南冬青组培快繁的技术体系，研究结果具有扩繁系数大、栽培管理便捷、成活率高、成本低等优点，能短时间内生产出大量海南冬青优质种苗，具有较好的应用前景。

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