无创性快速产前检测染色体非整倍体方法的研究进展*

程兰芳，丁洁琼，高彦茹，何智斌

(1.武汉市武昌医院检验科，湖北 武汉 430063；2.武汉市武昌医院痔瘘科；3.湖北科技学院基础医学院生理学教研室)



无创性快速产前检测染色体非整倍体方法的研究进展*

程兰芳1，丁洁琼3，高彦茹3，何智斌2*

(1.武汉市武昌医院检验科，湖北 武汉 430063；2.武汉市武昌医院痔瘘科；3.湖北科技学院基础医学院生理学教研室)

染色体异常中约75%为非整倍体，最常见的为21三体。核型分析为诊断性检测染色体非整倍体提供了金标准。然而，羊水、绒毛膜等标本来源具有创伤性，且结果回报时间超过2周。妊娠母体血中存在胎儿DNA使无创性产前检测成为可能，其后发展了多种分子生物学技术快速诊断染色体非整倍体。近来，游离胎儿RNA、胎儿DNA甲基化、比较基因组杂交等技术也用于研究无创性快速产前检测染色体非整倍体。本文就无创性快速产前检测染色体非整倍体方法的研究进展做一综述。

染色体非整倍体；核型分析；无创性产前检测；快速诊断方法

染色体异常是导致不育的主要原因，其中75%为染色体非整倍体，是由于基因遗传排列紊乱导致染色体量的异常；13%为多倍体；8%为性染色体异常；4%为结构失衡。常见的染色体非整倍体为21、13和18号染色体三体，21三体即唐氏综合征[1]，是由于21号染色体发生了额外的全部或部分复制，发病率约为1/800～1/600，高龄产妇的发病率较高。唐氏综合征患儿伴有智力障碍，严重的听力困难，甚至由于长期健康问题如心脏疾病等导致死亡[2]，给家庭和社会带来沉重的负担。防止染色体非整倍体患儿的出生依赖于产前筛查及诊断，现今，最有效的筛选胎儿染色体非整倍体的方法是危险性评估。

1 筛查染色体非整倍体

筛查染色体非整倍体分两步，第一步是进行21三体等染色体非整倍体的危险性评估。检测妊娠母体血清中的生物标志物[3]，如甲胎蛋白、未结合的雌三醇、绒毛膜促性腺激素、妊娠相关血清蛋白A、抑制素A等，同时超声评估胎儿颈部半透明层厚度，并综合考虑其它因素如母体年龄等。第二步是对危险性较高的患者进一步进行诊断性检测。通过羊水穿刺或绒毛膜穿刺等创伤性方法收集胎儿物质如羊水或绒毛膜，细胞培养后使用显微镜观察染色体带(核型)进行分析[4]。

然而，核型分析中羊水或绒毛膜标本由创伤性程序获得。这些创伤性诊断方法不仅价格昂贵，要求专业的技术人员参与，而且对胎儿有很大的危险，G带核型技术分辨率为5～10Mb，不能鉴定更微小的微丝粒区域重排。另外，细胞培养过程中也可能由于外源性污染等导致培养失败，甚至选择性地生长母体来源细胞。更重要的是，核型分析之前需要培养细胞10～14d，结果回报时间长。产前检测主要需要解决两个问题：①尽可能地避免不必要的创伤性检测程序。②快速分子检测以缩短结果回报时间。因此，很多研究致力于寻找新的无创性方法进行快速产前诊断染色体非整倍体，此研究在发现母体血循环中存在胎儿DNA之后有了重大突破。

2 母体血循环中存在胎儿DNA

无创性产前诊断的策略是基于观察到血浆中存在游离循环核酸，且在癌症患者血浆中增加。妊娠母体血循环中存在完整的胎儿细胞及游离的胎儿DNA，均可用于无创性产前诊断。母体血循环中完整的胎儿细胞很少(约1mL母体血中1个细胞)，富集效率很低，分娩之后在母体循环中持续存在。游离的胎儿DNA来源于合体滋养层凋亡后碎片，代表了细胞外DNA，其平均大小为300bp或者更小。在分娩后从母体循环中快速被清除，平均半衰期为16min。因此，游离胎儿DNA较完整的胎儿细胞更有利于用于产前诊断。然而，游离胎儿DNA仅占血循环中游离DNA的3%～6%，大部分均为较大片段的母体游离DNA。近年来使用更精确的数字PCR技术表明游离胎儿DNA的百分比可能近10%。母体血浆与血清中均存在游离胎儿DNA，产前诊断优先使用血浆，因为其包含较少的母体DNA背景。1997年，Lo等[5]报道，30名男性胎儿及13名女性胎儿母体血循环中使用10μL的血液样本用于PCR，结果显示血浆中检测出24例Y染色体阳性信号，血清中检测出21例Y染色体阳性信号。至此，一个新的无创性产前检测时代来临。使用游离胎儿DNA在无创性产前诊断的临床应用包括以下几个方面[6]：①决定胎儿性别；②决定胎儿RHD；③胎儿单基因常染色体紊乱；④胎儿标志物；⑤妊娠并发症；⑥无创性产前诊断胎儿染色体非整倍体。

3 无创性快速产前检测染色体非整倍体方法

母体血循环中存在胎儿DNA为无创性产前诊断提供了基础，而分子生物学检测方法则对于降低检测周期从1～2周至1～2d具有重要作用。快速非整倍体诊断(rapid aneuploidy detction，RAD)[7]方法包括荧光染色体原位杂交(fluorescence chromosomal in situ hybridization，FISH)、荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitation polymerase chain reaction，QF-PCR)、多种多样连接依赖的探针扩增(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)等。同时，根据母体血循环中存在胎儿RNA、胎儿DNA和母体DNA差异性甲基化、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)、二代测序等方法也可用于无创性快速产前检测染色体非整倍体。

3.1 FISH FISH用于快速产前检测染色体非整倍体，在过去20年间得到快速发展。FISH使用羊水等样本直接计数靶胎儿细胞内可见的荧光信号。Jia等[8]报道，FISH分析4210例羊水细胞标本，并与经典的核型分析结果比较，结果表明，97例为非整倍体，两种方法的一致性为97.9%，其中两种方法检测21、13、18三体的一致性为100%。FISH易操作、快速、高度敏感，然而，商业化探针价格昂贵。间期FISH有两个缺点，第一是FISH为高度密集型，耗费劳力。第二是可检测的位点少于12个，不易用于大量样本的临床检测。

3.2 PCR QF-PCR是基于检测荧光信号，与产生的PCR产物成比例。QF-PCR分析用于检测染色体非整倍体首次报道于20世纪90年代[9]，用于快速诊断(1或2d)常见的非整倍体(13、18、21、三倍体及性染色体非整倍体)。使用荧光引物PCR扩增13、18、21、X和Y染色体中的高度多态性的短串联重复序列，随之由分析仪自动化分析荧光强度。QF-PCR的优点包括自动化、便宜、快速而且敏感，可用于检测低拷贝的DNA，可同时进行大量样本检测；缺点是多种引物配对则定量的可靠性较差。MLPA也是基于PCR扩增理论，首次报道于2002年[10]，可用于检测基因定量异常。MLPA不是核酸而是探针加入样品中用于扩增及定量。每个PCR产物的相对定量是与靶序列中拷贝数量成比例的。MLPA优点：一个反应管中可包括50个不同的靶序列；不需要培养细胞；不是劳动密集型；便宜；检测可于30h内完成。主要缺点是为了区别扩增产物，探针包含一个非杂交的填充序列。因此，MLPA限制了探针的数量。

3.3 RNA 除了游离的胎儿DNA，胎盘起源的游离胎儿RNA也存在于母体血浆。通过分析胎盘特异性的mRNA，可用于检测胎儿染色体非整倍体，如定位于21号染色体的mRNA转录本(Placenta specific-4，PLAC4)和18号染色体的mRNA转录本(serpin peptidase inhibitor clade b2，SERBINB2)。PLAC4mRNA首次报道用于检测21染色体三体[11]，可将10例21三体病例从56例健康病例中区别开来，敏感性为90.1%，物异性为96.0%。使用SERBINB2mRNA用于检测18三体，四例18三体中有3例可鉴定为爱德华综合征。胎盘miRNAs也可存在于母体血浆，miRNAs为短的、19～25个核苷酸、单链、非编码的RNA。miRNAs可结合于靶mRNA的3' 端未翻译区域进行调节，多种miRNAs可调节单个基因，同时一种miRNAs可调节多个基因。母体血浆中大量胎盘miRNAs可能提供了一种无创性的工具用于监测胎盘中基因调节。

3.4 DNA甲基化 DNA甲基化是化学修饰的一种形式，将甲基添加到DNA分子上，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。使用差异性DNA甲基化的方法可用于区别不同起源的组织或细胞。使用母体与胎儿的差异性DNA甲基化用于无创性产前诊断首次报道于2002年，乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(SERPINB5)，定位于18号染色体，在胎盘中低甲基化，但是在母体血中高甲基化[12]。因此，检测SERPINB5基因的低甲基化与高甲基化比率可用于检测胎儿18三体。人类PDE9A基因[13]，编码cGMP特异性的磷酸二酯酶类(phosphodiesterases，PDEs)，定位于染色体21q22.3，表达于除血液外的大多数组织。Chim等[14]报道，PED9A在母体血中完全甲基化，但在胎儿组织(胎盘)中无甲基化。因此，PED9A标志物可独立于胎儿性别和基因型用于检测胎儿染色体非整倍体。Papageorgiou等[15]报道，14例21三体病例及26例正常对照，在孕期11.1～14.4周，采用胎儿特异性的甲基化比例可正确诊断胎儿21三体。

3.5 CGH CGH是一种高效的细胞遗传学技术，用于高分辨率、基因组范围筛选基因片段的变异[16]。阵列CGH早期使用的形式是BAC基础的阵列，基因组为BAC克隆(100～200kb)或者是合成的长度为25～75bp的寡核苷酸探针。阵列CGH的优点是分辨率高，若CGH用于产前诊断，胎儿细胞是由无创性产前程序获得，且不必要培养，因此结果回报可能更迅速。CGH检测也可用于自动化及高通量分析[17]，缺点如下：①要求事先知道基因组序列；②交互性杂交存在于相似的序列中；③很难检测低丰度的靶点；④样本DNA要求微克级的。“第二代”或“鸟枪法”测序则可解决以上这些问题。

3.6 二代测序 二代测序有如下特点：①知道基因组序列有帮助但不是必须的；②无实验性偏倚及交互杂交问题；③二代测序方法同等适用于检测样本中低丰度和高丰度的靶点序列；④需要钠克级而不是微克级样本DNA。二代测序可用于直接分析母体血浆中胎儿游离DNA并用于检测胎儿非整倍体。然而，高通量的DNA序列测定要求大量的生物信息用于分析，因此价格昂贵很难用于常规实验。巨大的平行的DNA鸟枪法测序(massively parallel DNA shotgun sequencing，MPSS)游离胎儿DNA片段用于决定其特异性的染色体起源。如21号染色体片段的百分比略有升高则表明胎儿可能有21三体，也有报道MPSS用于评估18三体和13三体[18]。MPSS是从完整的基因组中随机分析DNA，尽管前景不错，但是较复杂且具有高昂的花费。然而，数字分析选择性区域(Digital Analysis of Selected Regions，DANSR)可选择性评估来源于胎儿游离DNA的特异性基因组片段，使测序结果更有效并降低了成本[19]。同时，与一种新型的分析公式相结合，即胎儿部分三体的最大风险评估(Fetal-fraction Potimized Risk of Trisomy Evaluation，FORTE)，这种信息能够提供三体危险性的个体评估[20]。在最近发表的独立研究中，来源于400个11～13孕周的染色体整倍体孕妇，使用DANSR和FORTE可用于鉴别所有的21三体及98%的18三体病例[21]。

4 展 望

近来，新的分子技术应用于无创性产前检测染色体非整倍体领域。但是这些技术由于设备及价格昂贵，后续的生物信息分析难以完成，也要求考虑到伦理、法律和社会等问题[22]，很少用于临床实践中。因此，我们需要寻找大量的生物标志物，明确个体的基因组差异，增加筛选的精确性，将检测仅实施于高危险组。同时，我们需要将多种方法联合检测增强敏感性和特异性，最终实现无创性快速产前诊断胎儿染色体非整倍体的长期目标。

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武汉市卫生和计划生育委员会临床医学科研项目(WX14C68)

R596.1

A

2095-4646(2017)03-0274-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.03.0274

2016-12-26)

**通讯作者，E-mail：494527907@qq.com