两种方法检测绒山羊副结核的效果分析

张兴会，宋先忱，王世泉，刘孝刚，全治国，丁世伟，王家明，刘家欢（.辽宁省畜牧科学研究院，辽阳000；.锦州医科大学，辽宁锦州000；.辽宁省辽宁绒山羊原种场有限公司，盖州54）

疾病防控

两种方法检测绒山羊副结核的效果分析

张兴会1，宋先忱1，王世泉1，刘孝刚2，全治国3，丁世伟3，王家明1，刘家欢2
（1.辽宁省畜牧科学研究院，辽阳111000；2.锦州医科大学，辽宁锦州121000；3.辽宁省辽宁绒山羊原种场有限公司，盖州115214）

为探明绒山羊副结核检测方法的准确性，采用ELASA抗体检测法和注射副结核提纯菌素的皮内变态反应法进行了对比研究。结果表明：应用副结核分支杆菌抗体检测试剂盒测定的准确率可达到93%以上；采用测量皮厚差值的变态反应法，对副结核感染初期的羊只筛查效果较好。

绒山羊；副结核；ELASA法；皮内变态反应

羊副结核病是由耐酸的副结核分枝杆菌（MAP）引起的一种慢性肠炎，主要临床症状是严重腹泻，体重减轻，通常因采食被感染羊只粪便污物和饲料而感染此病。由于本病的潜伏期可达数月或数年，阳性羊只在成年前一般不表现发病症状。据最新调查统计，羊副结核在辽宁绒山羊主产区的感染率已超过10%，给绒山羊饲养业带来严重的经济损失，已严重制约绒山羊产业的健康发展。而当前，绒山羊养殖模式正向舍饲方向发展，与放牧方式相比饲养密度在加大，副结核病的防控形势也十分严峻。羊副结核病没有有效的治疗方法，发病羊会持续消瘦至死亡，因此，尽早筛查出副结核阳性羊，阻断传染源是防控措施的关键所在。本项研究采用皮内变态反应法和ELASA抗体两种方法检测副结核，以对比检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 ELASA抗体检测材料 负压采血管，离心管，副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒（IDEXX），MAP抗原包被板，阳性对照液，阴性对照液，酶标抗体浓缩液，稀释缓冲液，TMB底物液，终止液，浓缩洗涤液；未包被微量板，离心机，单道微量移液器，多道微量移液器，一次性移液吸头，微量反应震荡器，蒸馏水，盖板，96孔酶标仪。

1.1.2 皮内变态反应材料 试验用提纯副结核菌素：批号201109，规格为每瓶3mL，失效期2016-11-09；4℃以下保存，30头份，中国兽药监察所生产。75%酒精棉球，游标卡尺0～150mm，1mL兰心注射器，注射针头，剪毛剪，镊子，等等。

1.1.3 试验用羊 选自辽宁绒山羊联合育种的成年母羊。

1.1.4 试验时间及地点 时间：2015年4月至2016年8月。地点：辽阳市辽阳县吉洞乡。

1.2 分组

1.2.1 ELASA检测方法 应用副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒，对全场成年母羊先进行首测，筛选出MAP阳性羊、疑似羊和阴性羊，然后对不同结果的羊只抽检，分阶段跟踪检测，监测其血清抗体水平变化。从2015年4月开始，首检成年母羊317只，检出阳性羊46只（1组）、疑似羊8只（2组）、阴性羊263只，从中选一圈羊计132只（3组）。对分组羊进行二检和三检。

1.2.2 皮内变态反应测试 利用2015—2016年羊场开展的ELASA检测结果，对参加皮内变态反应羊只进行分组：3个月内两次ELASA检测阳性羊列为Ⅰ组，1个月内首次检测出的阳性羊为Ⅱ组，疑似羊为Ⅲ组，阴性羊列为Ⅳ组。通过接种提纯副结核菌素，观察其变态反应，对比与ELASA检测结果的符合度。

1.3 操作方法

1.3.1 ELASA法 每只母羊静脉采血3mL，析出的血清用1m L离心管封装、标记、冷冻。检测副结核（MAP）抗体前12h，将离心管放置在0～4℃冰箱内。在室温（20±2）℃环境下，按操作说明提示，利用酶标仪，通过样品的光密度值与阳性对照光密度的平均值相比较，诊断相关结果。每份样品的计算样品值设为S，阳性对照值设为P，计算样品的S/P值。S/P值小于或等于0.45，判为MAP抗体阴性（-）；S/P值大于0.45、小于0.55，判为MAP抗体可疑（±），应重新检测；S/P值大于或等于0.55，判为MAP抗体阳性（+）。

1.3.2 提纯副结核菌素测试法

1.3.2.1 注射部位 为尾根内侧，距肛门3 cm的中心部，先用卡尺测量注射前中央皮皱厚度，作好记录。

1.3.2.2 注射剂量 不论大小羊只，一律皮内注射0.1 mL。即将提纯副结核菌素每支加生理盐水3mL，皮内注射0.1mL。冻干副结核菌素稀释后当天用完。

1.3.2.3 注射方法 用75%酒精消毒术部，然后皮内注入0.1mL提纯副结核菌素，注射后局部应出现小泡，如注射有疑问时，应另选向后的部位重作。

1.3.2.4 注射次数和观察反应 皮内注射后经72 h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好记录。

1.3.2.5 结果判定 阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差等于或大于4mm以上者，其记录符号为（+）；疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差2.0～3.9mm之间，其记录符号为（±）；阴性反应：无炎性反应，皮厚差在2mm以下，其记录符号为（-）。

1.4 数据处理

利用SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 采用ELASA法二检和三检

采用ELASA法，在首检后3个月进行跟测，发现46只阳性羊中3只转阴，而疑似羊中转阴和转阳的羊各有3只，对首检为阴性的132只母羊跟测结果为4只转阳。在1个月后的三检中发现，二检中的50只阳性羊有2只转阴，44只阴性羊中有1只转为疑似。二检中由首检阳转阴的羊只，在三检也呈阴性，考虑与测定误差有关。而首检中的阴性羊后续出现的阳性羊只，应是在首检时属感染最初期未检测出有关。本统计结果表明，用ELASA检测的可靠性应达93%以上。

表1 E L ASA法跟踪检测结果

2.2 内变态反应结果

由表2可看出，ELASA检出阳性超3个月的母羊，其皮厚差测量结果为阴性；新感染副结核的羊只，其皮厚差达8.56mm±3.21mm，与说明书判定标准一致，且极显著高于其他各组（P＜0.01），其他各组间差异均不显著（P＞0.05）。ELASA检测为阴性的群体，按变态反应测量结果显示为疑似。表明采用皮内变态反应可筛选出在早期阶段感染副结核的个体，随着感染时间的延长，其皮内变态反应效果将不再明显。

表2 绒山羊皮内变态反应

3 讨论与建议

（1）牛羊副结核病自1835年发现以来一直流行于世界各地。关于羊副结核的检测方法曹敏慧等［1］采用皮内变态反应检出内蒙古阿拉善羊副结核阳性个体。本研究验证了在感染副结核初期的绒山羊，通过变态反应可明确地筛选出受感染者，而随着感染时间的延长，变态反应的强度会变得不明显，这应是和感染初期免疫应答反应敏感度高有关。

（2对有副结核感染的羊群，可进行一次提纯副结核菌素检疫，将发病羊和新感染的羊筛查出后，迅速隔离，控制病源传播。现提纯副结核菌素每头份价格在15元左右，养殖户基本能够承担，因此，当发现自家羊群有持续腹泻、药物治疗无效的羊增多时，有必要进行变态反应检测。而对于规模化的种羊场，需采用ELASA法，对场内成羊检测，及时挑出阳性羊。

（3）应用ELASA法检测副结核，准确度较高。但检测每份样品的成本费用在45元左右，适宜有经济条件的规模场。从隔离的阳性羊后续饲养观察发现，在饲养管理条件较差的情况下，感染羊一年后的死亡率达60%。在中等以上的饲养水平下，70%以上的羊只不会有发病症状表现。无临床症状的感染羊虽是传播副结核病的根源，但对种用价值高的个体，还是先采取隔离观察为宜。

（4）在辽宁绒山羊主产区，对该病防治建议采用以下措施：①及时淘汰发病羊，净化羊群，规模化种羊场定期进行副结核筛查；②加强饲养管理，尤其在枯草期和母羊哺乳期，因此阶段羊只体况和免疫力较差，感染后会迅速发病；③对非疫区养殖场最好坚持自繁自养，并定期接种副结核灭活苗，增强其免疫力；④定期用消毒剂对圈舍、食槽和饮水槽进行消毒，粪便作堆集发酵处理，病死畜无害化处理消灭传染源［2］。

［1］曹敏慧，李国中，达能太.山羊副结核菌素变态反应诊断［J］.中国畜禽种业，2011（8）：128-129.

［2］王涛，吴星星，马卫平，等.羊副结核病的诊断报告［J］.中国畜禽种业，2016（1）：107.

S827.7

A

2095-3887（2017）01-0038-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.011

2016-11-23

辽宁省科学技术厅农业攻关及产业化项目（2015103036）；现代农业产业技术体系专项（CARS-40-15）

张兴会（1972-），男，研究员，硕士，主要从事绒山羊繁殖与疫病防控技术研究工作。

宋先忱（1959-），男，推广研究员。